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人源蛋白Vav2和Arap3的结构与功能研究

作　者: 吴勃
导　师: 施蕴渝; 吴季辉
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: Vav2 Arap3 SH2结构域 ArfGAP结构域疏水相互作用
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在本论文中,我们发现并证实了Arap3是Vav2的一个新的相互作用蛋白,Vav2是小GTP酶Rac的鸟苷酸交换因子(GEF),而Arap3是小GTP酶Arf6和RhoA的GTP酶激活蛋白(GAP)。我们发现Vav2的SH2结构域可以识别Arap3的两个酪氨酸磷酸化位点pY1403和pY1408,并进一步利用NMR手段解析了Vav2SH2结构域与小肽Arap3-pY1408复合物的溶液结构。此外,我们还对Arap3的ArfGAP结构域进行了初步的结构研究。第一章是关于Vav2和Arap3以及相关的小GTP酶的背景介绍。Vav2和Arap3都是细胞内重要的信号转导蛋白,都被发现在细胞的扁平伪足形成和细胞迁移过程中发挥关键的作用。第二章是关于Vav2与Arap3的相互作用研究以及Vav2SH2结构域与小肽Arap3-pY1408的复合物结构解析。我们首先发现并证明了Vav2与Arap3之间存在相互作用,它们之间的相互作用受到Arap3磷酸化水平的调节,突变Arap3上的两个酪氨酸磷酸化位点pY1403和pY1408严重减弱了Vav2与Arap3的结合。磷酸化位点pY1403所在的蛋白序列YEEP与已报道了Vav2SH2结构域的偏好性一致,而pY1408所在的蛋白序列YEEV,残基Val处在pY+3位置与已报道的Vav2SH2结构域的偏好性不同。根据我们的核磁滴定和ITC实验,小肽pY1403和pY1408与Vav2SH2结构域都具有较高的结合能力,解离常数(Kd)分别为～0.271μM和～1.40μM。通过对Vav2-SH2/小肽pY1408复合物的结构解析发现,Vav2-SH2结构域的pY+3疏水结合口袋比较浅,小肽pY+3位的Val残基的侧链与位于这个疏水口袋表面的残基存在大量的疏水相互作用。第三章是关于ArfGAP结构域的信息以及我们对Arap3的ArfGAP结构域的溶液结构研究。我们通过限制性酶解的方法选取了Arap3上的一个蛋白片段,这个片段包含整个ArfGAP结构域以及位于ArfGAP结构域C-端的约30个氨基酸残基大小的延伸区域。目前已经完成了化学位移认证工作,结构解析正在进行。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
目录  6-9
第1章绪论人源蛋白Vav2和Arap3的研究进展  9-33
  1.1 引言  9-11
  1.2 Rho家族和Arf家族的小GTP酶  11-15
    1.2.1 Rho家族小GTP酶  11-12
    1.2.2 ARF家族小GTP酶  12-15
  1.3 Rac与RhoA以及Rac与Arf6之间的关系  15-19
    1.3.1 Rac与RhoA相互拮抗的关系  15-18
    1.3.2 Arf6与Rac之间的关系  18-19
  1.4 Vav2蛋白的研究进展  19-23
    1.4.1 Vav2的结构域组成以及其GEF酶活的调控  19-20
    1.4.2 Vav2蛋白的功能  20-22
    1.4.3 Vav2 SH2结构域的重要性  22-23
  1.5 Arap3蛋白的研究进展  23-27
    1.5.1 ARAP蛋白家族  23-24
    1.5.2 Arap3的GAP底物专一性以及其GAP活性的调控  24
    1.5.3 Arap3的功能  24-26
    1.5.4 已发现的与Arap3相互作用的partners  26-27
  1.6 总结  27-28
  参考文献  28-33
第2章人源Vav2 SH2结构域的结构功能研究  33-73
  2.1 引言  33
  2.2 SH2结构域的研究背景  33-37
    2.2.1 SH2结构域的主要特征  34-35
    2.2.2 SH2结构域的类型  35-36
    2.2.3 一些特殊的SH2结构域  36-37
  2.3 实验材料与方法  37-54
    2.3.1 实验中所用到的原始质粒以及抗体来源  37-38
    2.3.2 引物设计与合成  38
    2.3.3 聚合酶链式反应(PCR)体系  38
    2.3.4 胶回收PCR产物以及双酶切制造粘性末端  38-39
    2.3.5 连接与转化  39
    2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)  39-40
    2.3.7 大肠杆菌重组质粒的鉴定  40
    2.3.8 重组蛋白表达  40-41
    2.3.9 His-tag-Vav2 SH2镍柱亲和纯化  41-42
    2.3.10 分子筛纯化  42
    2.3.11 GST-tag亲和纯化  42
    2.3.12 蛋白浓度测定  42-43
    2.3.13 突变质粒的构建  43
    2.3.14 哺乳动物细胞的培养与传代  43-44
    2.3.15 哺乳动物细胞的保存与复苏  44
    2.3.16 哺乳动物细胞表达质粒的构建  44
    2.3.17 哺乳动物细胞的转染  44-45
    2.3.18 实验中所用到的细胞处理方法  45-46
    2.3.19 Western blot  46-47
    2.3.20 GST Pull-down实验  47-48
    2.3.21 免疫共沉淀实验  48
    2.3.22 等温量热滴定实验(ITC)  48-49
    2.3.23 NMR滴定化学位移扰动实验  49-50
    2.3.24 解析蛋白质三维溶液结构的核磁实验以及原始数据的处理  50-51
    2.3.25 主链和侧链化学位移的认证  51-52
    2.3.26 NMR结构计算  52-54
  2.4 实验结果与讨论  54-70
    2.4.1 Arap3是Vav2新的相互作用蛋白  54-55
    2.4.2 Vav2与Arap3的相互作用受到Arap3磷酸化水平的调节  55-56
    2.4.3 Vav2的SH2结构域介导Vav2与磷酸化的Arap3直接相互作用  56-57
    2.4.4 Vav2 SH2结构域克隆,表达与纯化  57-58
    2.4.5 Vav2-SH2结构域直接结合Arap3 C末端两个酪氨酸磷酸化位点  58-59
    2.4.6 Vav2 SH2结构域的对小肽pY+3位残基的选择性  59-60
    2.4.7 Vav2-SH2结构域与小肽Arap3-pY1408复合物溶液结构解析  60-62
    2.4.8 Vav2 SH2结构域与小肽Arap3-pY1408复合物结构描述  62-63
    2.4.9 小肽pY1408与Vav2 SH2结构域的特异性相互作用  63-65
    2.4.10 Vav2SH2/Arap3-pY1408复合物与其它SH2/小肽复合物结构比较  65-68
    2.4.11 Vav2与Arap3相互作用可能的生物学意义  68-69
    2.4.12 APP和Nectin-3是Vav2可能的相互作用蛋白  69-70
  2.5 总结与展望  70-71
  参考文献  71-73
第3章人源Arap3蛋白ArfGAP结构域的结构研究  73-95
  3.1 引言  73
  3.2 ArfGAP结构域的研究进展  73-80
    3.2.1 小GTP酶的GAP简介  73-75
    3.2.2 ARF家族GTPases的GAP蛋白  75-76
    3.2.3 ArfGAP结构域  76-80
  3.3 实验材料与方法  80-83
    3.3.1 克隆边界的选择  80
    3.3.2 克隆与表达  80-81
    3.3.3 Arap3重组蛋白的纯化  81
    3.3.4 TEV蛋白酶切除His-tag  81
    3.3.5 胰蛋白酶限制性酶解以及质谱实验  81-82
    3.3.6 圆二色谱(CD谱)实验  82
    3.3.7 核磁实验  82-83
    3.3.8 主链弛豫实验  83
  3.4 结果与讨论  83-91
    3.4.1 Arap3蛋白PAH区域的克隆,表达,纯化及结构表征  83-85
    3.4.2 Arap3-PAH区域的限制性酶解以及质谱鉴定  85-86
    3.4.3 Arap3 AH区域的结构研究  86-87
    3.4.4 Arap3 AH区域溶液结构解析  87-89
    3.4.5 Arap3 AH区域的主链动力学  89-91
  3.5 总结与展望  91-92
  参考文献  92-95
致谢  95-96
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  96

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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