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三氯苯酚降解相关基因的合成与功能分析—PsUGT2I基因

作　者: 边琳
导　师: 熊飞; 姚泉洪
学　校: 扬州大学
专　业: 植物学
关键词: 糖苷转移酶 UDP-GTs UGTs 三氯苯酚 高效液相色谱法(HPLC) 植物降解 微生物降解 生物修复
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


三氯苯酚是一种含氯芳香环化合物,在自然界中难以降解,并对人类具有具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应,有六种同分异构体。目前,化学和物理分解法不仅费用高昂,效果差,甚至还会产生二次污染,研究还不是很完善。利用植物转基因技术,采用植物降解、微生物降解、或催化转化高毒性芳香化合物,将成为安全、快速、高效、经济的新型治理方法。糖基转移酶(Glycosyltransferase,简称GTs)超家族,在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子,如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上,形成聚糖或糖蛋白、糖脂等的酶。存在于植物体内的糖基转移酶是参与糖苷化的重要成元。而糖苷化过程是次级代谢的重要步骤。已经有报道,植物利用此过程可以对含有苯环的芳香烃、氯代物具有转化、降解的功能。本研究根据EMBL中公布的欧洲云杉(Picea Sitchensis)尿嘧啶-葡糖转移酶(UGT2夕基因,再依据植物密码子偏好性,利用PTDS法化学合成PsUGT2I基因。合成的PsUGT21基因翻译所得的氨基酸序列与网上公布的PsUGT2氨基酸序列一致。为了进一步分析PsUGT2I基因的功能,首先构建双元表达载体,电击转化到农杆菌中。通过蘸花法转化拟南芥。经潮霉素筛选、PCR检测,得到了转基因阳性植株。对转基因植株的生理分析表明,相对于野生型,PsUGT2I转基因拟南芥植株对2,4,5-TCP耐受性比较强；且转基因植株表现出较低的可溶性糖含量。同时,提取拟南芥蛋白液用作体外降解TCP分析,发现转基因植物对2,4,5-TCP的降解转化能力有所提高。然后构建胞内表达载体,通过电击转化得到转基因的毕赤酵母,来进一步研究PsUGT2I基因的功能。对于含有2,4,5-TCP的选择性培养基,转基因毕赤酵母具有更好的耐受性。液氮研磨法获得酵母蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白分子量在54KDa；高效液相色谱层析法显示在体外情况下,一小时可以降解43.3%的2,4,5-TCP。本研究可以为土壤污染的植物修复、微生物修复提供一个新的技术路线。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
符号及縮略语说明  9-11
第一章 文献综述  11-25
  引言  11
  1 葡萄糖基转移酶的性质、功能、催化机理及应用  11-15
    1.1 葡萄糖基转移酶的特征、分类与空间构型  11-13
    1.2 葡萄糖基转移酶的功能及催化机理  13-14
    1.3 葡萄糖基转移酶的应用  14-15
  2 三氯苯酚的概述  15-21
    2.1 三氯苯酚的性质及污染现状  15-16
    2.2 三氯苯酚的非生物降解研究进展  16
    2.3 三氯苯酚的生物降解研究进展  16-21
  3 常用合成目的基因的方法  21-23
    3.1 鸟枪法  22
    3.2 cDNA法  22
    3.3 PCR扩增法  22
    3.4 化学合成法  22
    3.5 直接分离法  22-23
  4 本研究的目的、内容与意义  23-25
    4.1 研究目的  23
    4.2 研究内容  23
    4.3 研究意义  23-25
第二章 TCP降解基因PsUGT2I的合成及鉴定  25-32
  前言  25
  1 材料与方法  25-27
    1.1 材料  25-26
    1.2 实验方法  26-27
  2 结果与序列分析  27-31
    2.1 PsUGT2I基因的合成  27-29
    2.2 目的基因  29-30
    2.3 PsUGT2I的序列分析和蛋白分析  30-31
  3. 讨论  31-32
第三章 目的基因在植物中的表达  32-51
  引言  32-33
  1 材料与方法  33-43
    1.1 材料  33-36
    1.2 方法  36-43
  2 结果与分析  43-51
    2.1 PsUGT2I农杆菌转化双元载体的构建  43-44
    2.2 PsUGT2I基因的拟南芥转化  44-45
    2.3 转基因拟南芥阳性植株的筛选  45-47
    2.4 转基因拟南芥阳性植株的PCR验证  47-48
    2.5 转基因拟南芥阳性植株的可溶性还原糖含量  48-49
    2.6 转基因拟南芥阳性植株的降解TCP情况  49-51
第四章 目的基因在酵母中的表达  51-65
  引言  51-52
  1 材料与方法  52-59
    1.1 材料  52-55
    1.2 方法  55-59
  2 结果与分析  59-63
    2.1 酵母表达载体的构建  59-60
    2.2 质粒载体的线性化验证  60
    2.3 酵母阳性克隆的筛选  60-61
    2.4 PsUGT2I蛋白浓度定量  61
    2.5 PsUGT2I的电泳检测  61-62
    2.6 HPLC法鉴定降解情况  62-63
  3 讨论  63-65
参考文献  65-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的学术论文目录  72-73

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境植物学
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