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转基因小麦种子的蛋白质组学分析和生理代谢调控研究

作　者: 郭红祥
导　师: 尹钧
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 转基因小麦反义Trx s基因种子生理代谢硫氧还蛋白
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

本文以转反义Trx s基因小麦豫麦18和其野生型小麦(对照)为研究对象,运用蛋白质组学、生物信息学、生物化学等研究技术,从小麦种子蛋白质组变化、蛋白质组分变化、糖类与蛋白质降解代谢关键酶变化、抗氧化酶变化等方面人手,研究反义Trx s基因转入小麦后诱导的小麦种子生理生化效应,分析反义Trx s基因在小麦种子生理代谢中的作用,更进一步揭示了Trx s基因的生物学功能,为其在作物品种改良及育种中的深入开发利用提供了理论基础。主要结论如下:1.建立了转反义Trx s基因小麦和野生型小麦蛋白质组差异表达谱。研究结果发现,在成熟的小麦种子中,有24个蛋白质在野生型小麦中高表达(5倍以上),3个特异表达,有19个蛋白质在转基因小麦中高表达(5倍以上),1个特异表达;在萌发2d的小麦种子中,有15个蛋白质在野生型小麦中高表达(5倍以上),有10个蛋白质在转基因小麦中高表达(5倍以上)。转基因小麦和野生型小麦蛋白质组差异表达谱的研究为建立相应的蛋白质组数据库提供了基础数据。2.转基因与野生型小麦差异表达的蛋白质分析表明,反义Trx s基因可以调节小麦籽粒代谢。主要表现在:(1)作用于酶抑制蛋白:木聚糖酶抑制蛋白Ⅰ(xylanase inhibitor proteinⅠ,XIP-Ⅰ)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。XIP-Ⅰ已被证明能够抑制大麦淀粉酶活性;serpin是thiocalsin(一种丝氨酸蛋白酶)的专一性抑制蛋白。(2)直接作用于糖类分解代谢酶、蛋白质和氨基酸代谢酶等。糖类分解代谢酶包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、6-磷酸葡萄糖异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC);蛋白质和氨基酸代谢酶包括谷氨酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、腺苷酰硫酸激酶(adenylylsulfate kinase,APK);RNA降解酶S3-RNase和能量代谢酶ATP synthase。(3)作用于转录因子WRKY transcription factor 6和代谢调节蛋白14-3-3 proteins和成熟酶K(maturase K-like protein)。WRKY transcription factor 6可与储存蛋白、α-淀粉酶、β-淀粉酶基因启动子的W-box结合,影响基因转录;14-3-3 proteins参与基因转录、primary metabolism、质膜H~+-ATPase(离子运输)、叶绿体和线粒体酶活性、糖合成酶、氨基酸合成酶、蔗糖降解酶、硝酸还原酶的调控;成熟酶K参与基因转录后加工过程。(4)增加籽粒硬度相关蛋白puroindoline b以及小麦抗性相关蛋白谷胱苷肽转移酶(Glutathionetransferase)和disease resistance protein OB5的表达。3.反义Trx s基因减缓KC1可溶性蛋白中代谢类蛋白和CM(三氯甲烷-甲醇,chloroform-methanol)蛋白之间的转化,在种子浸泡处理初期降低籽粒代谢类蛋白的含量,使籽粒萌发代谢速度下降。4.转基因减慢了种子萌发中蛋白质的降解代谢。转基因提高了小麦蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)的活性,促进麦谷蛋白形成后的进一步折叠聚集,易于形成谷蛋白大聚合体,且还原程度低,更难溶解,种子储藏蛋白的可降解性降低。另外,在转基因小麦中,thiocalsin的专一性抑制蛋白serpin的活性增高,thiocalsin受抑制的程度增加,活性降低;谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MHD)是依赖于巯基的酶,转基因小麦种子内硫氧还蛋白含量低,故谷氨酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性低于野生型小麦。因此,在转基因小麦种子中,储藏蛋白的可降解性降低和蛋白质降解酶活性的降低是导致蛋白质降解代谢缓慢两个主要原因。5.转基因降低了种子中糖类降解酶的活性。在种子萌发过程中,转基因小麦三种淀粉酶的活性均低于非转基因小麦,而三种酶的抑制态酶活性均高于非转基因小麦,表明转基因抑制了小麦淀粉酶的活性。硫氧还蛋白是一个多功能活性蛋白,在种子淀粉降解过程中,不仅可以调节淀粉酶的活性,也可以调节糖类降解代谢过程其它与巯基有关的酶活性,比如醛缩酶。6.在三种淀粉酶中,转基因与非转基因小麦α-淀粉酶总酶活性在萌发处理1d时就出现较大差异,β-淀粉酶总酶活性在萌发处理2d时出现较大差异,而脱支淀粉酶总酶活性的差异较小,因此,α-淀粉酶在启动小麦籽粒萌发过程中起了非常重要的作用。对α-淀粉酶的影响作用主要表现在两个方面:一是影响酶蛋白的合成或降解速度;二是通过抑制蛋白影响酶存在的活性状态。7.转基因抑制籽粒抗氧化物酶部分同工酶的活性,使转基因小麦的过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性低于野生型小麦。转基因能降低小麦籽粒吸水速度。

全文目录

中文摘要  8-10
第一章文献综述  10-35
  1.硫氧还蛋白研究  10-17
    1.1 Trx的种类  10-11
    1.2 Trx的氧化还原机制  11-12
    1.3 Trx靶蛋白的研究  12
    1.4 Trx的生物功能  12-16
      1.4.1 植物叶绿体中的功能  13
      1.4.2 植物线粒体内的功能  13-14
      1.4.3 Trx h家族与胞质硫氧还蛋白  14
      1.4.4 Trx与自交不亲和  14
      1.4.5 Trx参与抗胁迫  14
      1.4.6 Trx对淀粉合成代谢、种子发芽和苗发育的影响  14-16
      1.4.7 Trx与机体抗氧化  16
    1.5 转反义Trx s基因小麦研究  16-17
  2.蛋白质组学研究进展  17-27
    2.1 蛋白质组学概念  17
    2.2 蛋白质组学研究技术  17-21
      2.2.1 双向电泳  18-19
      2.2.2 生物质谱技术  19-20
      2.2.3 其它新技术  20-21
    2.3 功能蛋白质组学研究  21-23
      2.3.1 功能蛋白质组学的研究内容  22
      2.3.2 功能蛋白质组学的主要研究手段  22
      2.3.3 功能蛋白质组学研究  22-23
    2.4 小麦蛋白质组研究进展  23-26
      2.4.1 种子蛋白研究  23-24
      2.4.2 其它蛋白质研究  24-25
      2.4.3 谷蛋白聚集体的研究  25
      2.4.4 小麦差异蛋白质组研究  25-26
    2.5 双向电泳在生长发育研究中的应用  26-27
  3.本研究主要内容与技术路线  27-28
  参考文献  28-35
第二章转基因小麦种子蛋白质组分析  35-81
  前言  35-37
  1.材料与方法  37-48
    1.1 实验材料  37-41
    1.2 实验方法  41-48
  2.结果与分析  48-70
    2.1 小麦种子可溶性总蛋白提取和浓度测定  48
    2.2 小麦种子蛋白2-DE图谱及图像分析  48-51
      2.2.1 双向电泳图谱的重复性  48-49
      2.2.2 小麦种子蛋白质图谱的表达差异  49-51
    2.3 差异表达蛋白的MALDI-TOF-MS鉴定  51-57
    2.4 已鉴定的差异蛋白的功能分析  57-65
      2.4.1 野生型小麦成熟种子中高表达的蛋白质  57-59
      2.4.2 转基因小麦成熟种子中高表达的蛋白质  59-61
      2.4.3 野生型小麦萌发种子中高表达的蛋白质  61-62
      2.4.4 转基因小麦萌发种子中高表达的蛋白质  62-63
      2.4.5 反义Trx s基因在小麦籽粒代谢中的作用  63-65
    2.5 部分差异蛋白结构预测  65-70
      2.5.1 部分差异蛋白的二级结构预测  65-66
      2.5.2 部分差异蛋白的二硫键预测  66-69
      2.5.3 部分差异蛋白的高级结构预测  69-70
  3.讨论与结论  70-75
  参考文献  75-81
第三章反义Trx s基因对小麦种子蛋白质组分及其降解的调控效应  81-97
  前言  81
  1.材料与方法  81-85
    1.1 实验材料  81-82
    1.2 实验方法  82-85
  2.结果与分析  85-93
    2.1 反义Trx s基因对小麦胚乳KC1可溶性蛋白组分的影响  85-87
      2.1.1 小麦胚乳KC1可溶性蛋白组成分析  85-86
      2.1.2 小麦胚乳KC1可溶性蛋白不同组分的PAGE分析  86-87
    2.2 反义Trx s基因对小麦籽粒储藏蛋白降解特性的影响  87-89
      2.2.1 反义Trx s基因对小麦胚乳谷蛋白的影响  87-88
      2.2.2 反义Trx s基因对小麦胚乳储藏蛋白降解特性的影响  88-89
    2.3 反义Trx s基因对小麦胚蛋白的影响  89-90
    2.4 反义Trx s基因对小麦籽粒thiocalsin的影响  90
    2.5 反义Trx s基因对小麦籽粒苹果酸脱氢酶的影响  90-91
      2.5.1 反义Trx s基因对小麦籽粒苹果酸脱氢酶活性的影响  90-91
      2.5.2 反义Trx s基因对小麦籽粒苹果酸脱氢酶同工酶的影响  91
    2.6 反义Trx s基因对小麦籽粒谷丙转氨酶的影响  91-92
    2.7 反义Trx s基因对小麦籽粒内游离氨基酸的影响  92
    2.8 反义Trx s基因对小麦籽粒谷氨酸脱氢酶活性的影响  92-93
  3.讨论与结论  93-95
  参考文献  95-97
第四章反义Trx s基因对小麦种子淀粉降解的调控效应  97-107
  前言  97
  1.材料与方法  97-99
    1.1 实验材料  97-98
    1.2 实验方法  98-99
  2.结果与分析  99-103
    2.1 反义Trx s基因对α-淀粉酶活性的影响  99
    2.2 反义Trx s基因对β-淀粉酶活性的影响  99-100
    2.3 反义Trx s基因对脱支酶活性的影响  100
    2.4 反义Trx s基因对α-淀粉酶同工酶的影响  100-103
      2.4.1 不同成熟时期胚乳淀粉酶同工酶  100-101
      2.4.2 不同萌发时期胚乳淀粉酶同工酶  101-102
      2.4.3 不同萌发时期胚淀粉酶电泳  102-103
    2.5 反义Trx s基因对小麦籽粒萌发过程中醛缩酶(ALD)活性的影响  103
  3.讨论与结论  103-106
  参考文献  106-107
第五章反义Trx s基因对抗氧化酶等生理特性的影响  107-125
  前言  107
  1.材料与方法  107-111
    1.1 实验材料  107-109
    1.2 实验方法  109-111
  2.结果与分析  111-120
    2.1 反义Trx s基因对POD的影响  111-113
      2.1.1 反义Trx s基因对POD活性的影响  111-112
      2.1.2 反义Trx s基因对POD同工酶的影响  112-113
        2.1.2.1 不同成熟时期POD同工酶  112
        2.1.2.2 不同萌发时期POD同工酶  112-113
    2.2 反义Trx s基因对抗坏血酸过氧化物酶(APX)的影响  113-115
      2.2.1 反义Trx s基因对小麦籽粒APX活性的影响  113-114
      2.2.2 反义Trx s基因对小麦籽粒APX同工酶的影响  114-115
        2.2.2.1 不同萌发时期APX同工酶  114-115
        2.2.2.2 不同成熟时期APX同工酶  115
    2.3 反义Trx s基因对小麦籽粒SOD的影响  115-117
      2.3.1 不同萌发时期SOD同工酶  115-116
      2.3.2 不同成熟时期SOD同工酶  116-117
    2.4 反义Trx s基因对过氧化氢酶的影响  117-119
      2.4.1 反义Trx s基因对小麦籽粒过氧化氢酶活性的影响  117-118
      2.4.2 反义Trx s基因对小麦籽粒过氧化氢酶同工酶的影响  118-119
    2.5 反义Trx s基因对小麦籽粒硬度的影响  119-120
    2.6 反义Trx s基因对小麦籽粒萌发吸水速度的影响  120
  3.讨论与结论  120-123
  参考文献  123-125
论文主要结论与创新点  125-129
英文摘要  129-132
致谢  132-133
在读期间发表文章  133

转基因小麦种子的蛋白质组学分析和生理代谢调控研究

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