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抗克百威—三唑磷双特异性单克隆抗体研究

作　者: 金仁耀
导　师: 朱国念
学　校: 浙江大学
专　业: 植物保护
关键词: 克百威三唑磷双特异性单克隆抗体四体杂交瘤细胞酶联免疫吸附分析
分类号: S481.8
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本论文以杀虫剂克百威和三唑磷为研究对象,合成了一种克百威半抗原4—[[（2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]丁酸（BFNB）和两种三唑磷半抗原O-乙基,O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（3-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THBu）、O-乙基,O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（5-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THHe）,然后制备人工抗原,免疫小鼠,通过杂交瘤技术进行细胞融合,获得各自的杂交瘤细胞,并制备了相应的单克隆抗体,腹水效价在10⁶以上。在此基础上,采用细胞酶缺陷技术和显微操作技术进行四体杂交瘤细胞的试验研究,获得的单克隆抗体具有双特异性功能和反应性强的特点。试验对单克隆抗体及其ELISA方法进行了优化:使用Coming公司的COASTAR酶标板、以PBS（0.05M,pH8.0）为抗体包被缓冲溶液、CBS（0.05M,pH9.6）为抗原包被缓冲溶液,37℃包被2h、封闭溶液以2%脱脂牛奶、抗克百威单抗以0.05M PBS缓冲溶液的离子浓度（pH值为7.0）、而抗三唑磷单抗以0.02MPBS（pH值为7.4）为佳。研究建立了克百威和三唑磷直接竞争的ELISA方法（包被抗体模式）,结果表明,克百威ELISA方法的检测灵敏度120达到了1.89ng/mL（线性范围为1.11～45.95ng/mE）,三唑磷ELISA方法的检测灵敏度120达到了0.15ng/mL（线性范围为0.07～3.90 ng/mL）,经过对环境样品、水果和蔬菜等样品进行添加回收率试验,结果表明,除了米和面粉的回收率有所偏高外,其他样品的回收率结果均在75%～130%范围内波动,表明所建立的ELISA方法是可靠的。对分泌克百威的杂交瘤细胞采用8-氮鸟嘌呤筛选培养,使细胞HGPRT酶缺失,对分泌三唑磷的杂交瘤细胞采用6-氯嘌呤筛选培养,使细胞TK酶缺失,然后进行细胞融合、筛选、检测,获得了一株能分泌抗克百威和三唑磷的双特异性单克隆抗体的四体杂交瘤细胞（12C1-2H12）,制备腹水并纯化抗体,通过一系列的反应缓冲体系的筛选和优化,建立了相应ELISA方法。从灵敏度结果比较可知,双特异性单克隆抗体对克百威和三唑磷的检测灵敏度（120）分别为4.46ng/mL和0.36 ng/mL,与单克隆抗体相比略有降低(I₂₀升高)。交叉反应率实验结果表明所制备的双特异性单克隆抗体与克百威和三唑磷相应的结构类似物均无明显交叉反应。结果表明所制备的双特异性单克隆抗体具有很高的双特异性和较高的检测灵敏度。采用双特异性单抗ELISA方法,进行了土壤和水质样品、蔬菜和水果样品中克百威和三唑磷添加回收率试验,水样的检测结果略有偏高,尤其是自来水样;土壤、蔬菜和水果样品的回收率结果均在70～130%范围内,检测结果表明所制备的双特异性单克隆抗体能适用与环境样品、干粉样品,水果和蔬菜样品的检测,所建立的免疫分析方法准确可靠。通过以上试验研究,本文初步提出了较为系统的基于杂交瘤技术的双特异性单克隆抗体制备技术体系、以及相应的ELISA方法和评价技术,并对双特异性单克隆抗体方法原理进行了初步的研究与探讨。

全文目录

术语和缩略语表  9-11
致谢  11-12
摘要  12-14
Abstract  14-16
第一章前言  16-38
  1. 农药及其它小分子免疫分析技术研究与应用现状  16-28
  2. 农药多残留仪器分析技术的发展对小分子快速诊断技术提出了新的要求  28-31
  3. 单克隆抗体的优异性能是当前快速检测技术发展的重要途径之一  31-38
第二章抗三唑磷、抗克百威单克隆抗体的研制  38-70
  1 材料与方法  38-43
    1.1 试剂与药品  38-40
    1.2 缓冲液  40-41
    1.3 仪器与材料  41-43
    1.4 实验动物  43
  2. 实验方法  43-54
    2.1 三唑磷人工抗原的制备  43-44
    2.2 克百威人工抗原的制备  44-45
    2.3 抗三唑磷、抗克百威单克隆抗体的制备  45-50
    2.4 ELISA条件优化和方法的建立  50-53
    2.5 ELISA方法的确定  53-54
  3. 实验结果与分析  54-70
    3.1 三唑磷人工抗原的鉴定与结合比测定  54-55
    3.2 克百威人工抗原的鉴定与结合比测定  55
    3.3 效价测定  55-56
    3.4 ELISA条件优化  56-70
第三章双特异性单克隆抗体的制备  70-90
  1. 实验材料与方法  70-78
    1.1 实验材料  70-74
    1.2 实验方法  74-76
    1.3 ELISA条件优化和方法的建立  76-77
    1.4 ELISA方法的确定  77-78
  2. 结果与分析  78-90
    2.1 HGPRT酶缺陷型细胞株的筛选  78-79
    2.2 TK酶缺陷型细胞株的筛选  79
    2.3 双特异性单克隆抗体的制备  79-80
    2.4 优化工作浓度的测定  80
    2.5 有机溶剂的影响  80-81
    2.6 离子浓度的影响  81-82
    2.7 pH值的影响  82
    2.8 ELISA灵敏度的检测  82-83
    2.9 优化条件的总结  83-84
    2.10 抗体的特异性检测  84-86
    2.11 添加回收率测定  86-88
    2.12 双特异性单克隆抗体和单克隆抗体的比较  88-90
第四章总结与讨论  90-97
  1. 论文总结  90-91
  2. 问题探讨  91-95
    2.1 用于小分子农药免疫检测的双特异性单克隆抗体制备的基本原理和方法  91-92
    2.2 双特异性单克隆抗体免疫反应的特异性能  92-93
    2.3 双特异性单克隆抗体的免疫反应特异性能及与单抗、基因工程抗体、多簇抗原-抗体等的比较  93-94
    2.4 双特异性单克隆抗体制备关键技术及其主要影响因素的探讨  94-95
    2.5 双特异性单克隆抗体在免疫检测技术中的应用前景  95
  3. 创新点  95-96
  4. 不足与展望  96-97
参考文献  97-111
附录  111-112

抗克百威—三唑磷双特异性单克隆抗体研究

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