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多氯联苯降解菌的筛选及其降解性能研究

作　者: 贾凌云
导　师: 杨凤林
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 多氯联苯 生物降解 bph基因簇 中间代谢产物
分类号: X703
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


多氯联苯（Polychlorinated biphenyls,PCBs）是一类典型的、分布广泛的持久性有机氯代污染物,其组成复杂,理论上有209种同类物和异构体。近20年来,生物降解PCBs的研究一直是环境科学技术领域的热点,获得能够降解不同种类PCB同类物的高效好氧降解菌株是其中需要解决的关键问题。本论文首先以相似物为底物从变压器油污染点筛选获得了一株降解PCBs的新菌株,经分子生物学鉴定和生理生化指标鉴定,确认该菌株为肠杆菌属（Enterobacter sp.）,命名为LY402。进一步以Aroclor系列的PCBs混合物为研究对象,系统研究了该菌株对不同PCB同类物的降解能力及其影响因素;采用气相色谱-质谱联用技术对其中间代谢产物进行了鉴定;利用同源分析进行引物设计,通过PCR等方法对LY402中的PCB降解酶基因进行了全面解析,获得了如下研究结果:（1）Enterobacter sp.LY402休眠细胞在30℃对浓度为2mg/L的Aroclor1242、1254、1260的降解率分别能够达到87.3%、60%和29.1%。LY402能够降解高浓度的PCBs,LY402对100mg/LAroclor1242的6天降解率能够达到60%,说明该菌株具有很强的抗污染物毒性的能力。（2）Enterobacter sp.LY402对3mg/L的Aroclor系列（1242:1254:1260=1:1:1）混合物生物降解动力学研究表明,在无外加碳源的无机盐液体培养基中,经过6天降解,91个色谱峰中的51个消失,23个色谱峰的峰面积有不同程度的降低,10余个色谱峰的峰面积未见明显变化,75%Aroclor系列混合物被有效降解。（3）不同PCB同类物的生物降解速率相差很大,氯取代数量和取代位点是影响生物降解速率的主要因素。在氯取代数量影响PCB同类物生物降解率的考察中发现,2-5个氯取代的所有PCB同类物均能被LY402快速有效降解;95%的6氯代PCB异构体能够被有效降解;75%的7氯代PCB异构体能够被降解,其降解效果虽不如6氯代的PCB异构体高,但仍很明显;8氯、9氯取代的PCB同类物几乎未被降解。LY402对PCBs的降解总体上遵循随着氯取代数量的增多,生物降解速率降低的规律。研究发现,氯取代位点对PCB同类物和异构体的生物降解率有很大影响。Enterobacter sp.LY402既能降解邻位氯取代的PCBs,也能降解对位氯取代的PCBs,但对位氯取代（4,4＇和3,3＇,4,4＇）对生物降解具有明显的抑制作用。在112个PCB同类物中,有13个未被有效降解,其中的12个含有3,3＇,4,4＇氯取代位点,包括具有共平面或类共平面结构的高毒性PCBs。与已经报道的PCBs高效降解菌株相比,Enterobacter sp.LY402的PCBs降解效果总体上优于其它菌株。（4）Enterobacter sp.LY402降解PCBs代谢产物的研究表明,LY402在降解PCBs的过程中会产生不同取代位点的氯代苯甲酸,发现在降解过程中存在显著的好氧脱氯现象。同时证实LY402对PCBs的代谢产物氯代苯甲酸也有一定的降解作用,可以部分降解单氯代氯苯甲酸,但对两个氯以上取代的氯代苯甲酸降解效果不明显。（5）对Enterobacter sp.LY402降解PCBs的系列降解酶基因（biphenyl-catabolic gene,bph）进行了解析。发现在LY402的细胞中含有一个约20Kb的质粒,PCB降解相关基因均位于质粒上。根据降解基因的同源性设计引物、通过PCR扩增并对产物测序,获得了LY402中bph基因簇的几乎全部基因序列（10.65Kb）,通过序列比较分析发现,LY402的bph基因簇与已发表的PCB高效降解菌株Pseudomonas sp.LB400的相关序列高度同源,只在联苯双加氧酶的小亚基发生了一个碱基的突变(C70→T),该碱基突变导致一个氨基酸的变化(Thr24→Ile)。但LB400中的bph基因簇是处于1400Kb的巨型质粒上,由于两个菌株的种属亲缘性相差较远,对于二者PCB降解基因上的高亲缘性目前还缺乏准确的解释。（6）表面活性剂作为降解菌LY402的碳源能够明显促进PCBs的生物降解。在相同条件下,在以2g/L的生物表面活性剂月桂酸蔗糖酯和非离子表面活性剂Tween-80为碳源的生长细胞体系中,LY402对4mg/L Aroclor1242的12小时降解率分别达到75.4%和64.7%,比相同情况下的以联苯为碳源的降解体系降解率分别高出20.6%和9.9%。研究了月桂酸蔗糖酯对不同组成Aroclor系列PCBs生物降解率的影响。在2g/L月桂酸蔗糖酯生长细胞体系中,LY402对2 mg/L的Aroclor1242、1254、1260的生物降解率分别为98.5%、79.9%和64.5%,比相同情况下的休眠细胞体系分别提高了12.2%、19.9%和35.5%,尤其使6氯、7氯等高氯取代PCB同类物的生物降解率得到了显著提高。上述研究结果表明,Enterobacter sp.LY402是迄今发现的好氧降解效率最高、降解PCB同类物的种类最广的降解菌之一,对PCBs生物降解动力学和降解机理的研究使我们对微生物的降解能力有了更深入的认识,为进一步基因改造菌株、提高PCBs污染点的生物强化修复效率提供了依据。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
引言  12-14
1 生物降解多氯联苯研究进展  14-40
  1.1 引言  14
  1.2 多氯联苯性质表述  14-19
    1.2.1 多氯联苯的特征  14-15
    1.2.2 PCBs的污染状况及生物毒性  15-17
    1.2.3 PCBs的结构对其毒性影响  17-18
    1.2.4 多氯联苯的毒性当量因子  18-19
  1.3 生物降解多氯联苯研究进展  19-33
    1.3.1 PCBs的好氧降解  19-31
    1.3.2 PCBs的厌氧生物降解/还原脱氯  31-32
    1.3.3 生物修复在PCBs实际污染土壤中的应用  32-33
    1.3.4 结论和展望  33
  1.4 本论文研究目的和意义  33
  参考文献  33-40
2 多氯联苯高效降解菌的筛选及其鉴定  40-52
  2.1 引言  40
  2.2 实验材料及方法  40-44
    2.2.1 实验材料与试剂  40
    2.2.2 PCBs分析设备  40
    2.2.3 液体培养基组成  40-41
    2.2.4 固体培养基的配制  41-42
    2.2.5 降解菌LY402的复壮及驯化  42
    2.2.6 菌体生物量的测定  42
    2.2.7 PCBs降解菌筛选方法  42-43
    2.2.8 休眠细胞降解体系的制备  43
    2.2.9 液相样品预处理方法  43-44
    2.2.10 PCBs的定性定量方法  44
    2.2.11 16S rDNA分子生物学鉴定  44
    2.2.12 菌株的生理生化鉴定  44
  2.3 实验结果及讨论  44-51
    2.3.1 PCBs高效降解菌株的分离  44-45
    2.3.2 LY402对3种PCB同类物混合物降解能力的初步研究  45-46
    2.3.3 PCBs高效降解菌株的鉴定  46-48
    2.3.4 Enterobactersp.LY402的生理生化特性  48
    2.3.5 不同碳源对LY402生长的影响  48-49
    2.3.6 pH值和温度对LY402生长的影响  49-51
  2.4 小结  51
  参考文献  51-52
3 Enterobactersp.LY402对多氯联苯的生物降解规律研究  52-87
  3.1 引言  52
  3.2 实验材料及方法  52-62
    3.2.1 实验材料与试剂  52
    3.2.2 PCBs分析设备  52
    3.2.3 菌株液体培养基  52
    3.2.4 菌体生物量的测定  52
    3.2.5 休眠细胞降解体系的制备  52
    3.2.6 PCBs降解动力学实验体系的制备  52-53
    3.2.7 PCBs的定性定量分析方法  53-61
    3.2.8 液相样品预处理方法  61-62
  3.3 实验结果  62-76
    3.3.1 LY402休眠细胞对不同组成PCB混合物的降解能力研究  62-65
    3.3.2 Enterobactersp.LY402对高浓度PCBs的降解能力  65-67
    3.3.3 温度和pH值对PCBs生物降解的影响  67
    3.3.4 Enterobactersp.LY402对多氯联苯同类物的生物降解动力学研究  67-76
  3.4 讨论  76-84
    3.4.1 Enterobactersp.LY402对PCB同类物和异构体的降解速率常数比较  76-79
    3.4.2 氯取代数量对PCB同类物和异构体生物降解的影响  79-81
    3.4.3 氯取代位点对PCB同类物和异构体生物降解的影响  81-84
  3.5 小结  84-85
  参考文献  85-87
4 Enterobactersp.LY402降解PCBs的产物及相关基因解析  87-115
  4.1 引言  87
  4.2 实验材料和方法  87-95
    4.2.1 实验试剂  87
    4.2.2 实验仪器  87
    4.2.3 实验方法  87-95
  4.3 实验结果  95-110
    4.3.1 二种PCB同类物降解产物定性分析  95-98
    4.3.2 二种PCB同类物降解产物定量分析  98-100
    4.3.3 Aroclor1242降解产物的定性定量分析  100-101
    4.3.4 PCBs降解过程中脱氯现象的考察  101-104
    4.3.5 LY402细胞所含质粒的大小及功能研究  104-105
    4.3.6 PCB降解酶相关基因的分离与解析  105-110
  4.4 讨论  110-113
    4.4.1 Enterobactersp.LY402对PCB同类物降解途径分析  110-112
    4.4.2 Enterobactersp.LY402中携带bph基因簇的质粒分析  112-113
  4.5 小结  113
  参考文献  113-115
5 表面活性剂促进多氯联苯生物降解的研究  115-129
  5.1 引言  115-116
  5.2 实验材料及方法  116-117
    5.2.1 实验材料与试剂  116
    5.2.2 PCBs分析设备  116-117
    5.2.3 菌株液体培养基  117
    5.2.4 菌体生物量的测定  117
    5.2.5 生长细胞降解体系的制备  117
    5.2.6 PCBs的定性定量分析方法  117
    5.2.7 液相样品预处理方法  117
  5.3 实验结果  117-124
    5.3.1 表面活性剂为碳源对PCBs生物降解能力的影响  117-118
    5.3.2 月桂酸蔗糖酯浓度对Aroclor1242生物降解的影响  118-119
    5.3.3 蔗糖酯对不同组成PCBs生物降解的促进作用研究  119-124
  5.4 讨论  124-127
  5.5 小结  127
  参考文献  127-129
结论  129-131
展望  131-132
创新点摘要  132-133
附录A Enterobactersp.LY402的16srDNA序列  133-134
附录B Enterobactersp.LY402 bph基因簇序列  134-139
附录C Enterobactersp.LY402代谢Aroclor1242产物质谱图  139-142
附录D Enterobactersp.LY402生理生化指标鉴定报告  142-143
攻读博士学位期间发表学术论文情况  143-145
致谢  145-146

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 废物处理与综合利用 > 一般性问题 > 废水的处理与利用
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