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基础稳态重链铁蛋白和可诱导重链铁蛋白在肿瘤坏死因子诱导L929细胞死亡中的不同作用

作　者: 谢昌传
导　师: 韩家淮
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重链铁蛋白 动态离子库 活性氧
分类号: R341
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 75次
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内容摘要


肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一种细胞因子,它能诱导某些细胞系经半胱天冬酶（caspase）依赖的细胞死亡途径死亡（细胞凋亡）;与此同时,它也能够诱导另外一些细胞系通过非半胱天冬酶依赖的途径死亡（细胞坏死）。本文应用逆转录病毒随机插入介导基因失活的方法,以鼠纤维原细胞L929为材料,筛选在TNF诱导细胞死亡过程中起重要作用的基因。我们获得一株TNF抗性细胞株,其重链铁蛋白基因被破坏。用TNF处理此细胞株,细胞内的动态铁离子库（labile iron pool,LIP）上升幅度很小。我们同时发现,在野生型L929细胞中,TNF诱导LIP上升主要是通过细胞内储存的铁离子来补充。动态铁离子库（LIP）在TNF诱导细胞产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和活性氧依赖的细胞死亡过程中起重要作用。在重链铁蛋白基因被破坏的细胞(Fermut)中,重链铁蛋白减少导致细胞内储存的铁离子减少,最终使TNF诱导的细胞内LIP上升幅度变小。与其它细胞不同,L929细胞内的重链铁蛋白基因不能被TNF诱导表达。用TNF诱导表达系统在L929细胞中异位表达重链铁蛋白,TNF处理后,细胞内LIP上升被抑制,因LIP上升导致的细胞内ROS的产生也被抑制,进而抑制细胞死亡。因此,LIP在TNF诱导细胞死亡过程中起决定作用。它是基础稳态重链铁蛋白促进TNF诱导的细胞死亡和可诱导重链铁蛋白抑制TNF诱导的细胞死亡的一个共同的衡量标准。

全文目录


中文目录  4-7
英文目录  7-10
中文摘要  10-11
英文摘要  11-12
第一章 前言  12-37
  1 肿瘤坏死因子-α  12-26
    1.1 简介  12-16
    1.2 TNF-α诱导细胞死亡  16-23
      1.2.1 NFκB能抑制TNF作为死亡配体的作用  18-19
      1.2.2 TNF通过TNFR1和TNFR2诱导细胞凋亡  19-20
      1.2.3 JNK是TNF诱导细胞凋亡的调节子  20-23
    1.3 TNF-α诱导细胞坏死  23-26
      1.3.1 诱导细胞坏死的信号转导通路  24
      1.3.2 RIP1在细胞坏死中的作用  24-25
      1.3.3 PARP-1在细胞坏死中的作用  25
      1.3.4 ROS在死亡受体介导的细胞坏死中的作用  25-26
      1.3.5 小结  26
  2 ROS  26-29
    2.1 ROS在TNF激活JNK中的作用  27-28
    2.2 ROS与TNF诱导激活NF-κB的关系  28
    2.3 ROS在TNFR1介导的细胞凋亡中的作用  28-29
  3 铁蛋白  29-33
    3.1 铁蛋白的结构  30-31
    3.2 铁蛋白的表达调控  31-32
    3.3 铁蛋白和细胞内铁离子的自我平衡  32-33
    3.4 铁蛋白和氧化损伤  33
  4 立题背景  33-37
第二章 材料和方法  37-66
  2.1 实验药品和试剂  37
  2.2 DNA相关实验及方法  37-57
    2.2.1 质粒载体  37-41
      2.2.1.1 pBluescript SK(-)  37-38
      2.2.1.2 pcDNA6和pcDNA3  38-40
      2.2.1.3 kBF151  40
      2.2.1.4 pDisrup  40-41
    2.2.2 大肠杆菌(E.coli)感受态细胞的制备和DNA转化  41-42
      2.2.2.1 感受态细胞的制备  41-42
      2.2.2.2 DNA转化  42
    2.2.3 质粒DNA的提取  42-45
      2.2.3.1 小规模质粒DNA的提取(STET煮沸法)  42-43
      2.2.3.2 中等规模质粒DNA的提取  43-44
      2.2.3.3 大规模质粒DNA的提取(CsCl超速离心法)  44-45
    2.2.4 质粒DNA的工具酶处理  45-46
      2.2.4.1 DNA的限制性内切酶消化  45-46
      2.2.4.2 线性DNA的末端平滑化  46
      2.2.4.3 线性DNA 5′端的磷酸化  46
      2.2.4.4 线性DNA 5′端磷酸基团的去除  46
    2.2.5 纯化DNA片段  46-48
      2.2.5.1 DNA的琼脂糖电泳  46-47
      2.2.5.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA  47-48
      2.2.5.3 从溶液中回收DNA  48
    2.2.6 DNA连接反应  48
    2.2.7 PCR相关实验  48-52
      2.2.7.1 普通PCR反应  48-49
      2.2.7.2 PCR产物的克隆  49
      2.2.7.3 点突变  49-50
      2.2.7.4 3'RACE  50-52
      2.2.7.5 实时PCR  52
    2.2.8 哺乳动物细胞表达质粒的构建  52-54
      2.2.8.1 Ferritin全长及E62K/H65G突变体表达质粒的构建  52-53
      2.2.8.2 κBF-Full ferritin、κBF-CDS ferritin和κBF-HA ferritin的构建  53-54
    2.2.9 凝胶迁移实验  54-57
      2.2.9.1 生物素标记探针  54
      2.2.9.2 抽提核蛋白  54
      2.2.9.3 配制非变性聚丙烯酰胺凝胶  54
      2.2.9.4 EMSA  54-57
  2.3 细胞相关实验  57-60
    2.3.1 细胞培养  57-58
      2.3.1.1 细胞培养及相关溶液的配制  57-58
      2.3.1.2 细胞的传代和接种  58
    2.3.2 瞬时转染  58-59
      2.3.2.1 磷酸钙转染  58-59
      2.3.2.2 Lipofectamine 2000转染试剂转染  59
    2.3.3 TNF抗性细胞株的筛选鉴定  59-60
      2.3.3.1 逆转录病毒的包装  59
      2.3.3.2 TNF抗性细胞的筛选  59-60
      2.3.3.3 鉴定TNF抗性细胞中被失活的基因  60
    2.3.4 构建稳定表达细胞株  60
  2.4 用流式细胞仪分析细胞存活率和ROS  60-62
    2.4.1 细胞存活率测定  60-61
    2.4.2 测定胞内ROS的积聚  61-62
  2.5 蛋白质相关实验方法  62-64
    2.5.1 样品制备  62
    2.5.2 蛋白质的SDS-PAGE电泳与Westem blotting分析  62-64
  2.6 铁离子相关实验  64-66
    2.6.1 细胞内铁含量的测定  64-65
    2.6.2 细胞内相对LIP的测定  65-66
第三章 结果和讨论  66-93
  3.1 结果  66-89
    3.1.1 L929细胞内重链铁蛋白基因的破坏抑制TNF诱导细胞死亡  66-70
    3.1.2 Fer~(mut)细胞对TNF的抗性具有选择性  70-73
    3.1.3 zVAD增强TNF对Fer~(mut)细胞的细胞毒性  73-75
    3.1.4 重链铁蛋白缺失改变Fer~(mut)细胞内总铁离子含量和LIP基础水平  75-76
    3.1.5 LIP的上升与细胞内ROS的产生和细胞死亡相关  76-80
    3.1.6 Fer~(mut)细胞内储存铁含量少抑制TNF诱导的LIP上升  80-82
    3.1.7 重链铁蛋白在调节TNF诱导的LIP变化中起重要作用  82-87
    3.1.8 野生型L929细胞和Fer~(mut)细胞中NF-κB都能被TNF激活  87-89
  3.2 讨论  89-93
致谢  93-94
参考文献  94-118
图表索引  118-120
缩略语及中英文对照  120-124
在学期间发表论文  124

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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