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重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的表达、复性、纯化及中试生产工艺研究

作　者: 李树刚
导　师: 邓小燕
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: rhIL-1ra 包涵体 复性 离子交换层析 中试放大 内毒素 稳定性 质量鉴定
分类号: TQ464
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


现代生物技术,几乎使人们可以获得任何需要的蛋白,用于蛋白质结构和功能研究。然而,要利用这一技术获得大量的能够满足产业化需要、质量符合临床要求的药用蛋白,却面临巨大的挑战。蛋白质的复性和纯化,作为生物工程下游技术的重要部分,往往是以大肠杆菌为表达系统,生产特定蛋白药物的瓶颈。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)为白细胞介素-1(IL-1)家族的一员,能特异性地与IL-1受体结合,从而拮抗IL-1的各种生物学效应。在临床上广泛用于治疗IL-1参与病理变化过程的一些相关疾病。IL-1ra临床用量很大,每剂量高达100mg。但目前为止,国内还没有IL-1ra产业化生产的报道。因此本研究对重组IL-1ra中试生产工艺进行研究。首次成功地在中试规模下,将复性原理应用于IL-1ra包涵体复性,实现复性纯化同步完成,复性率达到70%,产物得率达到65%,比国内外最好产率提高3.7倍。这对于国内重组蛋白药物的产业化工艺研究具有重要的参考价值。本文主要研究结果如下:1.根据GenBank中人类IL-1ra基因序列(GenBank登录号: EF140714),兼顾稀有密码子和大肠杆菌密码子偏好性,改造编码序列,人工合成hIL-1ra成熟蛋白cDNA编码序列。构建原核表达载体pLY-hIL-1ra。通过对表达量和遗传稳定性的筛选,确定BL21为最适宿主菌,并成功构建工程菌株BL21/pLY-hIL-1ra。2.在揺瓶条件下对工程菌株BL21/pLY-hIL-1ra发酵条件进行初步摸索,确定最佳诱导时机为生长中期,诱导温度42℃,诱导时间为4h。在此基础上,进一步用3.7L发酵罐,对实验室条件下发酵工艺条件进行优化。确定的工艺条件为:①用半合成培养基,以甘油作为碳源,采用溶氧反馈分批补料培养方法进行发酵;②25%浓氨水调节pH维持在7.0左右,30℃培养5小时后,开始以脉冲方式流加补料液,通过调节转速、进气量、罐压、补料速度控制溶氧大于30%;③接种10小时后,升温到42℃,诱导4小时,菌体湿重达到58 g/L,表达量38%。将此工艺放大到30L发酵罐,菌体湿重可达60 g/L,重组蛋白质的表达量为34%。表明该工艺条件适合工程菌株的高密度发酵,达到了中试规模要求。3.在实验室规模下,对重组IL-1ra包涵体释放、洗涤和溶解条件进行初步研究。以获得的参数作为参考,放大到中试规模。确定中试规模条件为:①菌体破碎。高压匀浆破碎菌体,菌体(g):缓冲液(ml)=1:10,压力40M Pa,循环4次;破菌率可达96%,一次处理湿菌体量1 000g,可获得粗包涵体约250g;缓冲液组成:20 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,pH 8.0。②包涵体洗涤。洗涤分4步进行,洗涤缓冲液(ml):粗包涵体(g)=10:1,在搅拌罐内混悬,转速控制在200 rpm,每个洗涤步骤洗涤30min,目标蛋白的纯度可达72%。洗涤缓冲液组成:第一次为20 mM Tris-HCl,5mM EDTA, pH8.0;第二次为20 mM Tris-HCl,5mM EDTA,100 mM NaCl,1%TritonX-100,1M尿素,pH8.0;第三次为20 mM Tris-HCl,5mM EDTA,1%TritonX-100,100 mM NaCl,pH8.0;第四次为20 mM Tris-HCl,5 mM EDTA,pH8.0。③包涵体溶解。溶解缓冲液(ml):包涵体(g)=20:1,溶解时间6h,温度为室温,同时进行搅拌,转速为200 rpm。溶解缓冲液组成:20 mM Tris-HCl,5 mM EDTA,5 mM DTT,6M尿素,pH8.0。4.在实验室规模条件下,对IL-1ra包涵体色谱复性及纯化条件进行研究,实现复性和纯化同步完成。条件为:选择Q-Sepharose Fast Flow阴离子色谱;复性温度10℃,pH8.0;尿素浓度梯度为6mol/L降到2.1mol/L时,复性缓冲液用量4倍柱体积;线性流速为0.565cm/min;负载量为200ml,含目标蛋白约1 024mg;pH6.5条件下梯度洗脱,流速控制在6.0 ml/min,NaCl浓度由0到0.4M的时间控制在50min。在此条件下,蛋白收率约70%,样品生物比活性达到10万单位/mg,与Sigma公司销售的对照品一致,纯度达98%以上。以实验室条件作为参照,将此工艺成功放大到中试规模。选择BPGTMΦ70mm×L 500mm色谱柱,流速控制在0.754 cm/min,在复性温度、pH等与实验室规模一致的条件下,负载量增加到2 000ml包涵体溶液,含目标蛋白约10240mg,目的蛋白回收率65%,纯度98%,生物比活性达到10万单位/mg,与对照品一致,每升发酵液纯品产率为890mg。表明此工艺到达中试规模要求。5.内毒素去除。选用SP-Spharose Fast Flow强阳离子交换色谱,让内毒素直接穿出色谱介质,而样品仍保留在色谱介质上。通过进一步改变pH,让目标蛋白解吸下来,达到去除内毒素的目的,同时去除复性纯化样品中残留的尿素。在实验室条件基础上,将此工艺成功放大到中试规模,单次处理量达到6.7g目的蛋白,内毒素由200EU/mg-260EU/mg降低到小于0.5EU/mg,满足了安全用药的要求,回收率为93%。6.初步建立了原液的稳定性条件。20℃条件下,通过研究pH和保护剂浓度等因素对目的蛋白稳定性的影响,确定了保存目的蛋白活性的适宜条件为:pH6.5,蔗糖浓度为1.8%。7.对原液的质量进行了鉴定和检测。①理化鉴定:用MADLI-TOF MS法,进行分子量的测定,复性纯化后的rhIL-1ra分子量为17.224kD,与理论分子量一致;肽图分析和West-Blotting免疫特异性分析及N端15个氨基酸残基序列分析结果显示,复性纯化后的rhIL-1ra与对照品一致,基本证实复性纯化后的rhIL-1ra理化特性与理论一致。②纯度、活性检测:用RP-HPLC检测纯度,rhIL-1ra原液纯度大于98%,满足临床用药纯度要求;用小鼠胸腺细胞-MTT法测定活性,rhIL-1ra原液比活力10万U/mg,与对照品一致。③对部分安全性指标的检测结果显示,安全性指标满足2005版中国药典相关要求。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
1 绪论  13-41
  1.1 引言  13-14
  1.2 基因工程药物研究概况  14-18
    1.2.1 利用基因重组技术生产重组多肽和蛋白药物的优点  14
    1.2.2 国内外基因工程药物研究现状  14-17
    1.2.3 基因工程药物生产的基本过程和基本内容  17
    1.2.4 基因工程药物开发过程中，规模要求及放大过程  17-18
  1.3 基因工程药物开发的关键技术  18-32
    1.3.1 重组蛋白的表达  18-20
    1.3.2 蛋白质的纯化  20-22
    1.3.3 以包涵体形式表达的重组蛋白的复性与纯化  22-30
    1.3.4 基因工程药物质量控制  30-32
  1.4 白介素-1 及其相关受体和受体拮抗剂研究进展  32-38
    1.4.1 白介素-1(IL-1)  32-33
    1.4.2 白介素-1 受体(IL-1R)  33
    1.4.3 白介素-1 受体拮抗剂(IL-11a)  33-34
    1.4.4 IL-11a、IL-1 及IL-1R 相互作用关系  34-35
    1.4.5 重组IL-11a 的临床应用  35-37
    1.4.6 用基因工程的方法生产rhIL-11a 研究概述  37-38
  1.5 本文的技术路线及主要研究内容  38-39
    1.5.1 本研究技术路线图  38
    1.5.2 本文的主要研究内容  38-39
  1.6 本研究的创新点  39-41
2 E. COLI/HIL-1RA 表达系统的构建及发酵工艺研究  41-59
  2.1 引言  41
  2.2 本章技术路线  41-42
  2.3 材料与设备  42-43
    2.3.1 质粒和菌株  42
    2.3.2 主要仪器  42
    2.3.3 主要试剂  42-43
    2.3.4 试剂配制  43
  2.4 实验方法  43-49
    2.4.1 hIL-11a 全长基因的获得  43
    2.4.2 重组质粒pLY-hIL-11a 的构建  43-45
    2.4.3 重组菌株pLY-hIL-11a/ BL21 的构建  45-46
    2.4.4 重组子的筛选鉴定  46-47
    2.4.5 rhIL-11a 高表达菌株的筛选  47
    2.4.6 rhIL-11a 在大肠杆菌中的表达条件摸索  47-48
    2.4.7 发酵工艺研究  48-49
  2.5 试验结果  49-57
    2.5.1 pLY-hIL-11a 转化BL21  49
    2.5.2 重组质粒的鉴定  49-52
    2.5.3 huIL-11a 蛋白最佳表达菌株的筛选  52-53
    2.5.4 摇瓶培养条件研究  53-54
    2.5.5 最佳发酵pH  54-55
    2.5.6 碳源种类的选择  55-56
    2.5.7 pH 调控方式的选择  56
    2.5.8 30L 发酵结果  56-57
  2.6 本章小结  57-59
3 IL-1RA 包涵体的制备、洗涤、溶解及稀释复性研究  59-73
  3.1 引言  59-60
  3.2 实验材料和仪器  60-61
    3.2.1 试剂  60-61
    3.2.2 仪器与设备  61
  3.3 实验方法  61-62
    3.3.1 包涵体的释放  61
    3.3.2 包涵体的洗涤  61-62
    3.3.3 包涵体的溶解  62
    3.3.4 包涵体溶液的稀释复性  62
  3.4 分析方法  62-64
    3.4.1 包涵体纯度测定  63
    3.4.2 蛋白浓度测定  63
    3.4.3 复性率的计算  63
    3.4.4 活性测定  63-64
  3.5 试验结果  64-71
    3.5.1 包涵体的释放  64-65
    3.5.2 包涵体的洗涤  65-67
    3.5.3 包涵体溶解  67-68
    3.5.4 包涵体稀释复性  68-71
  3.6 本章小结  71-73
4 RHIL-1RA 色谱复性及纯化工艺研究  73-99
  4.1 引言  73-74
  4.2 试剂与设备  74-75
    4.2.1 试剂  74-75
    4.2.2 设备  75
  4.3 实验方法  75-79
    4.3.1 色谱法复性吸附条件研究和色谱法复性介质的选择  75-76
    4.3.2 阴离子交换层析复性条件研究  76-77
    4.3.3 rhIL-11a 纯化条件的优化  77-78
    4.3.4 实验室规模的rhIL-11a 复性纯化组分中内毒素去除  78-79
  4.4 中试规模放大研究  79-82
    4.4.1 高压匀浆破壁放大  79-80
    4.4.2 包涵体洗涤放大  80
    4.4.3 包涵体溶解放大  80
    4.4.4 复性与纯化中试工艺放大和工艺条件的确定  80-81
    4.4.5 内毒素去除中试条件放大实验  81-82
  4.5 实验结果  82-96
    4.5.1 rhIL-11a 色谱复性介质的选择  82-84
    4.5.2 Q-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析复性影响因素研究  84-88
    4.5.3 rhIL-11a 复性条件的确定与验证  88-89
    4.5.4 rhIL-11a 纯化条件的优化  89-90
    4.5.5 实验室规模rhIL-11a 复性并纯化条件验证  90-92
    4.5.6 rhIL-11a 复性纯化组分中内毒素去除条件  92
    4.5.7 中试规模放大  92-95
    4.5.8 内毒素去除中试放大实验  95
    4.5.9 中试复性纯化及内毒素去除条件验证  95-96
  4.6 本章小结  96-99
5 RHIL-1RA 下游中试复性纯化原液的质量检定  99-115
  5.1 引言  99-100
  5.2 试剂和设备  100-101
    5.2.1 试剂与耗材  100-101
    5.2.2 设备与仪器  101
  5.3 实验方法  101-107
    5.3.1 理化鉴别实验  101-102
    5.3.2 含量、纯度和活性测定  102-104
    5.3.3 安全性检测  104-107
    5.3.4 原液稳定性实验  107
  5.4 实验结果  107-114
    5.4.1 理化鉴定结果  107-110
    5.4.2 含量、纯度、生物活性测定结果  110-112
    5.4.3 部分安全性指标检测  112-113
    5.4.4 rhIL-1ra 稳定性实验  113-114
  5.5 结论  114-115
6 结论与展望  115-117
  6.1 全文结论  115
  6.2 展望  115-117
致谢  117-119
参考文献  119-129
附录  129
  攻读博士期间发表的论文  129

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产
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