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高山离子芥BADH基因和LEA基因的克隆、表达及功能分析

作　者: 张华
导　师: 安黎哲
学　校: 兰州大学
专　业: 植物学
关键词: 高山离子芥甜菜碱醛脱氢酶胚胎发育晚期丰富蛋白基因低温胁迫盐胁迫抗冻性抗盐性转基因烟草
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

高山离子芥（Chorispora bungeana Fisch．& C．A．Mey）是一种稀有的高山冰缘植物，具有很强抗寒能力，但它不具备特殊的形态结构，被推测它在生理和分子水平上具有特殊的抗冻机制。因此，高山离子芥是研究植物适应冷冻环境和克隆植物抗逆基因的理想材料。本文以高山离子芥为实验材料，克隆到甜菜碱醛脱氢酶基因（CbBADH）和胚胎发生晚期丰富蛋白基因（CbLEA）。对CbBADH基因在不同处理条件下的基因表达模式和甜菜碱的积累进行了研究；通过农杆菌介导的叶盘法将CbLEA基因成功地转化了烟草，并对转基因烟草的抗逆性和CbLEA蛋白的功能进行了分析，内容概括如下：1．从高山离子芥中克隆了甜菜碱醛脱氢酶基因（CbBADH），此基因全长1729bp，编码502个氨基酸的蛋白，分子量为54.5KD，等电点为5.30。氨基酸序列分析表明，CbBADH蛋白中含有与酶活性位点和结合位点相关的十肽VSMELGGKSP。CbBADH蛋白与其他已经发现的BADH蛋白的同源性在73.3％～95.4％之间，其中与拟南芥的同源性最高，达到了95.4％，说明克隆到的基因属于BADH基因家族。2．外源表达和纯化的CbBADH蛋白具有氧化甜菜碱醛的能力，并且在不同的pH值下其酶活性不同，pH 8.0时活性最大。证明CbBADH基因确实是甜菜碱醛脱氢酶的功能基因，其编码的蛋白能催化甜菜碱醛合成甜菜碱，其酶活性不因保守十肽中的L被M代替而受到影响。3．检测CbBADH基因在冷冻胁迫（4℃、0℃和-4℃）下的表达情况，发现它的转录物在4℃逐渐积累，而在0℃和-4℃的积累更直接和迅速。这表明CbBADH基因的表达与温度密切相关、对温度反应敏感。所以CbBADH基因的表达是高山离子芥传递抵御低温胁迫信号的一个重要保护机制。随着胁迫强度的增大，植物启动这个保护机制就越迅速。这恰恰就反映了高山离子芥具有适应温度剧烈变化的能力。4．高山离子芥是甜菜碱积累型的植物，在低温胁迫下能够迅速积累甜菜碱以调节细胞的渗透势。在温度和时间梯度上，随着温度的降低甜菜碱的积累迅速增加，并且甜菜碱的积累并不是不断增加的，而是有一定的限度的（在低温胁迫下它增加了3倍），当达到一定的浓度时，甜菜碱含量就维持在相对稳定的水平。这一结果表明在高山离子芥中，甜菜碱的渗透调节具有一定的局限性，当胁迫强度超过一定范围，它的调节能力不再增强。同时表明，渗透调节只是高山离子芥低温保护机制的一种，但并不是最主要的，在高山离子芥中可能存在其他特殊的低温保护机制。5．从高山离子芥中克隆了胚胎发生晚期丰富蛋白基因（CbLEA），此基因全长842bp，编码169个氨基酸的小分子蛋白，其分子量为17.9KD，等电点为6.45。亲水性分析表明该蛋白富含亲水氨基酸，是一种高度亲水性的蛋白，其蛋白二级结构中只含有83.43％的α-螺旋占和16.57％的无规卷曲。CbLEA蛋白除了与拟南芥的LEA蛋白同源性为87.57％外，与其他已经发现的LEA蛋白的同源性都不高，一般在35.84％～52.78％之间，说明克隆到的CbLEA蛋白是一种新的LEA蛋白。6．通过农杆菌介导法将CbLEA基因转化烟草，经PCR、Real time RT-PCR和Western blot确定了阳性转基因植株，并且检测了转基因植株中CbLEA蛋白的积累量。发现各转基因株系地CbLEA蛋白积累量不同，这就为研究CbLEA蛋白在植物抗逆过程中的作用提供了很好的研究对象。7．通过对转基因烟草的T₁代幼苗进行生理测定和生长分析发现，在盐和低温胁迫下转基因植株的生长状况都较野生型植株好，转基因植株的种子萌发率、相对含水量和叶绿素含量都比野生型植株高，而其离子渗漏率、丙二醛含量又明显的低于野生型植株。转基因烟草细胞的半致死温度为-3℃，而野生型的仅为-2℃，并且在-2℃的低温下，转基因烟草存活时间较野生型要长。这说明CbLEA是一种真正的抗逆基因，转基因烟草的抗盐和抗冻性明显得到提高。8．进一步研究发现，转基因烟草抗逆性提高的程度似乎与CbLEA蛋白的积累量呈正相关，CbLEA蛋白积累量越大，转基因烟草的抗逆性越强，反之亦然。这一结果更加充分地证明CbLEA蛋白在胁迫条件下对植物细胞起保护作用。综上所述，高山离子芥中也存在甜菜碱的渗透调节途径，说明植物在抗寒分子机制方面具有保守性，克隆的基因具有潜在的抗寒功能；同时，甜菜碱的渗透调节具有一定的局限性，渗透调节只是高山离子芥低温保护机制的一种，但并不是最主要的，在高山离子芥中可能存在其他特殊的低温保护机制。转基因植物的抗逆性分析表明高山离子芥CbLEA蛋白在胁迫条件下可能通过结合水分子、维持膜结构而达到保护细胞的作用，高山离子芥的抗逆基因较其它植物的抗逆基因而言在抗冻方面似乎具有显著的优势。

全文目录

缩写词表  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-14
第一章绪论  14-35
  1.植物抗逆的分子机制  14-20
  2.甜菜碱醛脱氢酶基因的研究  20-25
  3.LEA蛋白基因的研究  25-31
  4.高山冰缘植物研究概况  31-33
  5.选题的目的和意义  33-35
第二章材料和方法  35-53
  第一节高山离子芥BADH基因的克隆及其表达分析  35-41
    1.试验材料  35
      1.1.实验室高山离子芥再生植株培养  35
      1.2.高山离子芥愈伤组织、悬浮细胞的培养  35
    2.方法  35-41
      2.1.高山离子芥甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)的克隆  35-36
      2.2.高山离子芥BADH基因的原核表达及酶活性分析  36-39
      2.3.低温胁迫下高山离子芥甜菜碱的积累  39
      2.4.高山离子芥BADH基因在低温胁迫下的表达分析  39-41
  第二节高山离子芥LEA基因的克隆及其对烟草的转化  41-53
    1.试验材料  41
    2.方法  41-53
      2.1.高山离子芥胚LEA基因的克隆  41-42
      2.2.高山离子芥LEA基因的原核表达及分离纯化  42-44
      2.3.高山离子芥CbLEA蛋白的抗体制备  44-45
      2.4.农杆菌介导的高山离子芥LEA基因转化烟草  45-48
      2.5.转基因烟草的分子鉴定  48-50
      2.6.转基因烟草的抗逆性分析  50-51
      2.7.基因枪法转化高山离子芥LEA基因  51-53
第三章结果  53-88
  第一节高山离子芥BADH基因的克隆及其表达分析  53-65
    1.高山离子芥BADH基因的克隆  53-54
    2.高山离子芥BADH基因的特性分析  54-59
    3.高山离子芥CbBADH基因的原核表达及酶活性分析  59-62
    4.低温胁迫下高山离子芥甜菜碱的积累  62-63
    5.高山离子芥CbBADH基因的表达  63-65
  第二节高山离子芥LEA基因的克隆及其对烟草的转化  65-88
    1.高山离子芥LEA基因的克隆  65-66
    2.高山离子芥LEA基因及LEA蛋白的特性分析  66-70
    3.高山离子芥LEA基因的原核表达及分离纯化  70-72
    4.高山离子芥CbLEA蛋白抗体的效价测定  72
    5.农杆菌介导的高山离子芥CbLEA基因转化烟草  72-74
    6.转基因烟草的分子鉴定  74-76
    7.转基因烟草的抗逆性分析  76-86
    8.基因枪法转化烟草  86-88
第四章讨论  88-94
  第一节高山离子芥BADH基因的克隆及其表达分析  88-91
  第二节高山离子芥LEA基因的克隆及其对烟草的转化  91-94
参考文献  94-105
在读期间研究成果  105-106
致谢  106-107

高山离子芥BADH基因和LEA基因的克隆、表达及功能分析

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