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TNFα自体疫苗的制备、筛选及其对TNFα表达过高相关疾病治疗作用的研究

作　者: 万一
导　师: 张英起
学　校: 第四军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肿瘤坏死因子 自体疫苗 佐剂 谷胱甘肽巯基转移酶 T细胞辅助表位 恶病质 内毒素休克 类风湿性关节炎
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


研究背景TNFα是一种具有复杂生物活性的细胞因子,它主要由巨噬细胞和T细胞产生。该分子除了能够在体内或体外杀伤肿瘤细胞外,还具有抗病毒感染、激活巨噬细胞及多形核粒细胞、促进组织相容性抗原表达、调节机体免疫机能等多种功能。但是当肿瘤坏死因子过量表达时,它与其它炎症因子一起产生多种病理损伤,如自身免疫性疾病,感染性疾病,恶液质等。因此,中和体内过量的TNFα,可为上述疾病的治疗提供一条有效途径。目前临床上通过中和体内过量的TNFα治疗上述疾病的药物有:TNFα单克隆抗体和TNFα可溶性受体,但是这些药物存在用药量大、需长期反复使用、易引起超敏反应的缺陷。疫苗只需少量注射就可以诱发产生抗体,可克服抗体及可溶性受体药物的缺陷,因此TNFα疫苗是治疗此类疾病的一条有效途径。目的本研究的目的是筛选出一种TNFα自体疫苗分子,使之能够在体内诱导出针对TNFα分子的特异性中和抗体,为TNFα表达过高的相关疾病提供一种新的治疗药物。方法构建GST融合的小鼠TNFα(mTNFα)系列截短体,使其在大肠杆菌中获得高效表达,菌体蛋白经SDS-PAGE后,切胶免疫小鼠,通过对诱导抗体滴度的分析并结合计算机辅助设计确定外源T细胞辅助表位的插入位置。将编码TT830-844(QYIKANSKFIGITEL), HEL46-61(NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的基因序列替换编码小鼠TNFα126位至140位氨基酸序列的核酸,获得编码mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE基因片段,将其插入pBV220原核表达载体,转化大肠杆菌,在大肠杆菌中经表达、纯化后得到mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE融合蛋白,构建出三种TNFα融合蛋白疫苗。用构建的三种疫苗分子免疫小鼠,体外比较免疫的抗血清针对mTNFα的抗体滴度和中和活性,筛选最有效的T细胞辅助表位。用筛选得到的mTNF-PADRE治疗LPS诱导的内毒素休克小鼠,mTNFα诱导的恶病质小鼠以及Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠,观察治疗效果。结果通过对小鼠TNFα系列截短体诱发的抗mTNFα抗血清滴度检测和对人和小鼠TNFα抗原表位预测,结果发现小鼠TNFα126位至140位氨基酸可以作为外源T辅助表位替换的位置。我们用外源的T辅助表位替换小鼠TNFα126-140位氨基酸,构建了mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE三种TNFα融合蛋白疫苗,经纯化纯度均可达到95%以上。L929细胞的杀伤活性试验结果表明,mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE均不具有TNFα的细胞杀伤活性。免疫小鼠结果发现mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE均可在小鼠体内诱导出小鼠TNFα结合性和中和性自身抗体,比较其效果,mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。无佐剂的mTNF-PADRE免疫小鼠可以有效地延长LPS诱导的内毒素休克小鼠的生存期,减少mTNFα诱导的恶病质小鼠的体重减轻的幅度以及减轻Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型(CIA)小鼠的症状。结论通过对表位插入位置和插入的表位的筛选,我们筛选的mTNF-PADRE分子可以有效地诱导出针对mTNFα的中和性自身抗体,并且不具有TNFα的L929细胞杀伤活性。动物试验表明mTNF-PADRE在无佐剂的情况下可以有效地缓解LPS诱导的内毒素休克,mTNFα诱导的恶病质以及CIA小鼠的症状。因此其对应的人TNF-PADRE分子可以作为TNFα自体疫苗的候选分子。

全文目录


缩略语表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言和文献回顾  11-33
  前言  11-12
  文献回顾  12-33
    1 TNFα的研究进展  12-17
    2 针对自身抗原的免疫治疗研究进展  17-28
    3 针对 TNFα免疫治疗的研究进展  28-33
正文  33-119
  实验流程与技术路线  33-34
  实验材料  34-40
  第一部分 选择改构的 TNFα基础分子  40-60
    1 试验方法  40-48
    2 实验结果  48-59
    3 讨论  59-60
  第二部分 选择外源T细胞辅助表位插入位置  60-77
    1 试验方法  60-64
    2 实验结果  64-75
    3 讨论  75-77
  第三部分 外源T细胞辅助表位的筛选及自体疫苗分子的制备  77-99
    1 试验方法  77-86
    2 实验结果  86-97
    3 讨论  97-99
  第四部分 mTNF-PADRE对TNFα表达过高相关小鼠疾病模型的治疗  99-119
    1 试验方法  99-102
    2 试验结果  102-116
    3 讨论  116-119
小结  119-121
参考文献  121-134
个人简历和研究成果  134-136
致谢  136

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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