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微生物来源的氯代邻苯二酚1，2-双加氧酶基因在拟南芥中降解芳香族化合物的机理研究

作　者: 廖阳
导　师: 蒯本科
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 氯代邻苯二酚1，2双加氧酶 植物修复 生物降解 邻苯二酚 拟南芥 叶绿素酶 叶绿素降解 AtCLH1 AtCLH2
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


使用微生物来源的污染物降解相关基因改造植物，可以使植物获得降解污染物的能力而用于环境治理，这是一种有效的清除污染物的方法。芳香族化合物是现在工农业生产中产生的一类主要污染物。此类污染物具有化学性质稳定苯环结构，难以降解。在此项研究中，我们利用邻单胞杆菌来源的氯代邻苯二酚1，2双加氧酶基因tfdC改造拟南芥，探索植物降解芳香族污染物。氯代邻苯二酚1，2双加氧酶在微生物研究中已经被证实具有打开苯环的能力。本研究中获得的转基因植株在形态和生长状态上与野生型植株没有可见的差别。通过分析发现，tfdC转基因植株对芳香族化合物邻苯二酚的耐受性相对于对照植株有了显著的提高，并显示出显著提高的吸收和转化邻苯二酚的能力。HPLC分析结果进一步显示在植株内部检测到的邻苯二酚的代谢产物顺，顺-己二烯二酸的量远远少于预期应产生的量。据此，我们推测植物内部可能具有类似于细菌邻位降解途径中TfdC下游的TfdD和TfdE酶活性，使得降解产物顺，顺-己二烯二酸进一步被降解。利用生物信息学方法检索拟南芥基因组数据库，我们确实在植物中发现了TfdD和TfdE的同源蛋白，而没有发现TfdC的同源蛋白。可见，tfdC基因赋予转基因植物的TfdC酶活性在植物降解芳香族化合物过程中是至关重要的，也同时预示着细菌来源的基因在植物降解环境中芳香族污染物应用中的良好前景。叶绿素酶(EC 3.1.1.14)催化叶绿素降解的第一步反应。叶绿素酶基因的克隆推动了对叶绿素酶生理生化特性的研究，也有助于揭示叶绿素酶在植物体内作用的机制。在拟南芥中有两个叶绿素酶基因，AtCLH1和AtCLH2。AtCLH1的相关研究报道比较多，关于其体内的功能也已有报道，而对AtCLH2的研究则相对较少。本研究中，我们在体外表达纯化了由AtCLH2编码的叶绿素酶2。叶绿素酶2在体外表现出了叶绿素酶的活性。我们还发现，与由AtCLH1编码的叶绿素酶1相比，叶绿素酶2在体外达到最大叶绿素酶活性需要更高浓度的去污剂(Triton X-100)或极性溶液(丙酮)。为了进一步研究AtCLH2在植物体内的功能，我们采用了RNA干扰的方法抑制了拟南芥中AtCLH2的表达。同野生型拟南芥相比，RNA干扰的转基因植株中叶绿素含量基本不变，而叶绿素酸酯含量则显著下降，使得叶绿素与叶绿素酸酯的比值显著升高。另外，我们还注意到AtCLH1和AtCLH2的表达谱有一定的差别。我们的结果显示AtCLH2在体内叶绿素代谢中可能扮演着一个不同于AtCLH1的角色。

全文目录


Ⅰ.微生物来源的氯代邻苯二酚1,2-双加氧酶基因在拟南芥中降解芳香族化合物的机理研究  5-36
  中文摘要  6-7
  英文摘要  7-8
  综述  8-16
    1 环境污染问题  8-9
    2 微生物中芳香族化合物降解途径  9-10
    3 植物修复  10-12
    4 遗传工程在植物修复中的运用  12-14
    5 本实验室以往的研究工作  14-15
    6 本实验的主要工作  15-16
  材料与方法  16-19
  结果  19-30
    1 转基因植株的筛选,鉴定和观察  19
    2 邻苯二酚和顺,顺-己二烯二酸的植物毒性  19-20
    3 tfdC基因在CT植株中的表达  20-21
    4 CT植株中TfdC活性测定  21
    5 CT植株在含有邻苯二酚培养基上的抗性观察  21-23
    6 CT植株在土壤中的邻苯二酚抗性观察  23-26
    7 CT植株在水培系统中的邻苯二酚抗性观察  26
    8 HPLC分析CT植株代谢邻苯二酚的能力  26-27
    9 植物内源的TfdD和TfdE类似活性  27-30
  讨论  30-33
  参考文献  33-36
Ⅱ.拟南芥中叶绿素酶基因的功能研究  36-62
  中文摘要  36-37
  英文摘要  37-38
  综述  38-47
    1 叶绿素降解简介  38-39
    2 叶绿素降解途径  39-42
    3 叶绿素降解途径中的基因和突变体  42-46
    4 本论文的主要工作  46-47
  材料与方法  47-51
  结果  51-56
    1 重组叶绿素酶2的体外活性  51
    2 重组叶绿素酶的活性比较  51-53
    3 RNAi转基因植株的分子鉴定  53-54
    4 RNAi植株体内叶绿素与叶绿素酸脂的变化  54
    5 AtCLHs的不同表达谱  54-56
  讨论  56-58
  参考文献  58-62
发表论文  62-63
致谢  63-64

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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