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利用生物芯片技术检测转基因农作物

作　者: 许嘉
导　师: 沈大棱
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 转基因农作物寡核苷酸芯片转基因农作物检测多重PCR 品系特异连接区域序列
分类号: S188
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 458次
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内容摘要

随着转基因农作物检测技术的不断发展，PCR技术已经成为最主要的检测方法之一。但是常规的PCR每次只能扩增一个基因，而单独的多重PCR和常规电泳相结合的技术由于受多重PCR技术自身限制，每次扩增的基因数目也很有限，因此不能满足当前转基因农作物检测的要求。寡核苷酸芯片是一种在基片上点有若干寡核苷酸探针的基因芯片，每个点都含有序列特异的探针以和感兴趣的基因相互补结合。因此，寡核苷酸芯片可以和多重PCR技术相结合用来同时检测多种目标基因。在这篇论文中，我们开发了多重PCR技术和DNA芯片技术相结合的方法，在同一个反应中同时检测多个目标基因，以达到检测转基因农作物的目的。我们设计了两大类芯片，其中一类用来检测样本是否是转基因农作物，另一类用来检测样本来自于哪一种转基因品系。对于第一类芯片，我们使用了20种探针用以检测转基因农作物，按照具体功能可以分为三种：第一种，根据一些普通元件例如启动子、终止子、报告基因等来检测是否为转基因农作物；第二种，根据目标基因例如抗除草剂或是抗虫害基因来做特定基因的检测确认；第三种，根据物种特异性基因来检测该样本来自于哪种作物。为保证方法的有效性，设立不同的阳性对照和阴性对照来鉴定该实验方法，并且通过常规PCR反应和测序来进一步验证。结果表明这种方法可以快速识别样本是否为转基因农作物，并且花费少，效率提高。这种方法可以检测目前95％以上的转基因作物，并且对于大豆的最低检出率是0.5％，玉米是1％。对于第二类芯片，根据唯一的、品系特异的宿主与插入片断间连接区域的基因序列，通过多重PCR和寡核苷酸芯片相结合的技术，以达到检测出样本来自于哪种转基因品系的目的。转基因农作物商品大豆(GTS 40-3-2)和六种转基因玉米(MON810，MON863，Bt176，Bt11，GA21和T25)通过这种方法进行检测。结果表明对于这些转基因大豆和玉米，该方法均可以适用。以上两种芯片被证明是一种新的转基因农作物检测的常规方法。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-27
  一、生物技术研究概况  10-17
    1.1 生物技术的定义  10-11
    1.2 生物技术发展沿革  11-13
      1.2.1 近代生物学发展历程  11-12
      1.2.2 现代生物技术的兴起  12-13
    1.3 生物技术发展概况  13-17
      1.3.1 世界生物技术发展概况  13-16
      1.3.2 我国生物技术研究和开发成就  16-17
  二、生物安全  17-20
    2.1 普及生物科学知识,正确认识生物技术引起的安全性问题  17
    2.2 生物技术专利权与伦理道德  17-18
    2.3 亟待加强我国的生物技术安全性研究  18-20
  三、转基因生物的安全问题  20-25
    3.1 世界范围内转基因生物安全问题发展概况  20-22
      3.1.1 美国的转基因生物安全工作  20-21
      3.1.2 其他国家的转基因生物安全工作  21-22
    3.2 我国的转基因生物安全工作  22-23
    3.3 转基因生物安全性研究的代表性事件  23-25
  四、生物芯片研究进展  25-27
    4.1 生物芯片的产生  25
    4.2 生物芯片的简单介绍  25-26
    4.3 生物芯片的特点和作用  26-27
第一章生物芯片的研制  27-34
  1.1 材料与方法  27-28
    1.1.1 材料  27
      1.1.1.1 玻片材料  27
      1.1.1.2 主要的仪器设备  27
    1.1.2 方法  27-28
      1.1.2.1 PCR产物的荧光标记及纯化  27-28
      1.1.2.2 点样  28
      1.1.2.3 点样后处理  28
      1.1.2.4 检测与分析  28
      1.1.2.5 统计学处理  28
  1.2 实验结果  28-31
    1.2.1 样本的制备  28
    1.2.2 DNA固定效率  28-31
  1.3 讨论  31-33
    1.3.1 基片的制备  31
    1.3.2 氨基修饰玻片和醛基修饰玻片的差别  31-32
    1.3.3 寡核苷酸探针的合成  32
    1.3.4 点样液的选择  32-33
  参考文献  33-34
第二章筛选型芯片的研制  34-51
  2.1 材料与方法  34-40
    2.1.1 材料  35
      2.1.1.1 样品和标准参照材料  35
      2.1.1.2 主要的仪器设备  35
    2.1.2 方法  35-40
      2.1.2.1 DNA的抽提  35-36
      2.1.2.2 引物设计  36
      2.1.2.3 寡核苷酸探针设计  36
      2.1.2.4 PCR及荧光标记  36-39
      2.1.2.5 DNA芯片的制备  39
      2.1.2.6 杂交  39
      2.1.2.7 检测和结果判断  39-40
  2.2 结果与分析  40-49
    2.2.1 各类检测芯片检测结果  40-43
      2.2.1.1 普通筛选芯片  40-41
      2.2.1.2 物种特异检测芯片  41-42
      2.2.1.3 综合型转基因农作物检测芯片  42-43
    2.2.2 基因芯片的特异性和准确度  43-46
    2.2.3 PCR体系的优化  46-47
    2.2.4 筛选型芯片的种类  47-49
  参考文献  49-51
第三章品系特异型芯片的研制  51-64
  3.1 材料与方法  52-57
    3.1.1 材料  52-53
      3.1.1.1 样品和标准参照材料  52
      3.1.1.2 主要的仪器设备  52-53
    3.1.2 方法  53-57
      3.1.2.1 DNA的抽提  53
      3.1.2.2 引物设计  53-54
      3.1.2.3 寡核苷酸探针设计  54-55
      3.1.2.4 PCR及荧光标记  55-56
      3.1.2.5 DNA芯片的制备  56
      3.1.2.6 杂交  56-57
      3.1.2.7 检测和结果判断  57
  3.2 结果与分析  57-61
    3.2.1 品系检测鉴定型芯片点样示意图  57-58
    3.2.2 品系检测鉴定型芯片结果  58
    3.2.3 灵敏度实验  58-59
    3.2.4 对照的选择  59
    3.2.5 阳性和阴性阈值的判断  59-61
  参考文献  61-64
附件1-转基因产品筛选试剂盒试检验结果表  64-65
附件2-商品化的GMO所含主要基因统计表  65-68
附件3-商品化的GMO品种含有的定性筛选基因  68-71
附件4-稳定性实验结果表  71-80
博士期间发表的学术论文  80-81
致谢  81-82

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