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OxyR蛋白调控鼠疫耶尔森氏菌抗氧化杀伤作用的研究

作　者: 邱业峰
导　师: 朱平
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鼠疫耶尔森氏菌 OxyR调控蛋白刺激元调控元凝胶迁移实验 DNA酶I足迹实验引物延伸实验
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

利用一步法突变技术成功构建了鼠疫菌?oxyR突变株。为了证实鼠疫菌OxyR蛋白与H2O2抗性的相关性,我们设计了一系列H2O2抗性的表型实验,结果表明oxyR基因是否表达与鼠疫菌抵抗H2O2的杀伤作用直接相关。巨噬细胞内存活与繁殖是鼠疫菌得以最终致病的关键阶段。感染巨噬细胞实验结果表明,鼠疫菌野生株和?oxyR突变株感染巨噬细胞的相关的黏附吞噬率差异不显著,说明OxyR在鼠疫菌感染巨噬细胞的黏附过程没有发挥明显作用。而感染巨噬细胞吞噬率差异显著,提示OxyR可能在鼠疫菌抵抗巨噬细胞吞噬的过程中发挥作用。通过鼠疫菌全基因组DNA芯片,对鼠疫耶尔森氏菌H2O2刺激元和OxyR调控元进行了的研究,H2O2刺激元转录谱分析结果显示,鼠疫菌的抗氧化机制主要包括清除活性氧(katA和katY)调控元、渗透压相关蛋白、修复DNA损伤(SOS调控元)和cys调控元等。OxyR调控元转录谱分析鉴定了大量OxyR调控元基因,进一步证实了oxyR通过调控oxyR调控元发挥抗氧化作用。结合转录谱结果和生物信息学知识,挑选了14个基因作为研究对象,在大肠杆菌中表达并纯化了可溶性的OxyR蛋白后,通过凝胶迁移实验(EMSA)证实了OxyR蛋白能够结合这些基因启动子区,说明了这些基因受OxyR调节蛋白直接调控。利用了DNA酶I足迹实验和引物延伸实验对过氧化氢酶基因katA和过氧化物酶基因katY进行研究,确定了OxyR蛋白结合这两个基因启动子区的位置和序列,以及这两个基因的转录起始位点。本研究的主要创新之处是通过全基因组DNA芯片,确定了鼠疫耶尔森氏菌H2O2刺激元和OxyR调控元。通过凝胶迁移实验、DNA酶I足迹实验和引物延伸实验证实了部分的OxyR调控元基因。

全文目录

提要  5-6
英文缩写词表  6-9
前言  9-13
第一篇文献综述  13-45
  第一章鼠疫  13-21
    1 鼠疫的流行概况  13-15
    2 鼠疫耶尔森氏菌生物型分类  15-16
    3 鼠疫耶尔森氏菌病原学  16-18
    4 鼠疫耶尔森氏菌基因组学  18-21
  第二章氧化压力响应  21-45
    1 氧化压力和活性氧物质  21-26
    2 活性氧物质的生理功能  26-27
    3 活性氧物质造成的氧化损伤  27-30
    4 细胞内氧化压力的响应  30-37
    5 细胞内氧化压力响应的调控  37-43
    6 与真核生物氧化压力响应的比较  43-45
第二篇研究内容  45-119
  第一章鼠疫菌△oxyR 突变株的构建  45-51
    1. 材料与方法  45-48
    2 结果  48-49
    3 讨论  49
    4 小结  49-51
  第二章鼠疫菌野生株和△oxyR 突变株的H_2O_2 抗性研究  51-59
    1 材料  51-55
    2 结果  55-56
    3 讨论  56-58
    4 小结  58-59
  第三章鼠疫菌野生株和△oxyR突变株H_2O_2适应性研究  59-65
    1 材料  59-61
    2 结果  61-63
    3 讨论  63-64
    4 小结  64-65
  第四章鼠疫菌野生株和△oxyR 突变株感染巨噬细胞实验  65-69
    1 材料和方法  65-66
    2 结果  66-67
    3 讨论  67-68
    4 小结  68-69
  第五章鼠疫耶尔森氏菌H_2O_2刺激元和OxyR 调控元的研究  69-89
    1 材料和方法  69-75
    2 结果和讨论  75-81
    3 小结  81-89
  第六章 OxyR 调控元的分子生化实验验证  89-119
    1 材料和方法  89-105
    2 结果  105-113
    3 讨论  113-118
    4 小结  118-119
结论  119-123
参考文献  123-136
中文摘要  136-139
英文摘要  139-142
致谢  142-143
导师简介  143-145
CURRICULUM VITAE  145

OxyR蛋白调控鼠疫耶尔森氏菌抗氧化杀伤作用的研究

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