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“shotgun”蛋白质组学策略解决若干生物工程问题研究

作　者: 王玉霞
导　师: 元英进
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 蛋白质组学 2D LC-MS/MS 细胞核蛋白质组预分离定量蛋白质组学 18O同位素标记
分类号: Q81
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本文尝试运用“shotgun”蛋白质组学研究技术和策略解决生物工程中的问题。首先将蛋白质组学应用于抗生素代谢途径的研究;其次将蛋白质组学应用于肿瘤生物标志物和潜在药物靶标的寻找;在此基础上,引入18O同位素标记技术,定量地考察K562细胞调亡过程中蛋白质组的变化。结果如下:运用2D LC-MS/MS分析了藤黄灰链霉菌抗生素生产期菌株103和cnn1的总蛋白,分别得到726和809个蛋白。运用生物信息学手段,结合实验室研究结果,将所有可能的代谢途径关键酶在所构建的数据库中进行搜索,两个菌株中均发现有聚酮合成途径的关键酶聚酮合成酶和其它几个与该途径相关的酶,说明麦拓莱霉素通过聚酮合成途径合成。结合β-酮酯酰合酶的抑制剂实验结果,说明以上结论的正确性。展示了蛋白组学在寻找生物合成途径方面的价值。基于“shotgun”、一维凝胶电泳预分离策略,分离鉴定了K562细胞总蛋白提取物,得到1707个蛋白。运用生物信息学手段,对肿瘤生物标志物和药物靶标进行了预测,表明MLL3、SET、DEK、Stathmin、Nucleophosmin等蛋白可能为潜在的生物标志物或治疗肿瘤和白血病的药物作用靶点。通过亚细胞分级、一维凝胶电泳、串联质谱分析了K562细胞核蛋白质,共鉴定了334个蛋白。其中检测到了与肿瘤发生、发展、诊断相关的重要基因产物,包括NF45 protein、PIBF1、DDX48、IKAP等蛋白,提供了可深入研究的肿瘤相关分子靶标。采用18O同位素标记法定量比较了多烯紫杉醇诱导k562细胞凋亡过程中可溶性蛋白质组的变化,在所分析的86个蛋白中,46个蛋白表达量没有发生变化,15个蛋白表达量下调,包括SET蛋白、延长因子EEF1A1等;20个蛋白表达量上调,包括α-烯醇酶、过氧化物还原酶等。这些被抑制和被激活的蛋白可能为肿瘤生物标志物和药物作用靶点,为肿瘤的诊断和治疗提供了新的候选蛋白。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
前言  9-11
第一章文献综述  11-29
  1.1 后基因组时代的有力工具――蛋白质组学  11-17
    1.1.1 蛋白质组学的出现是后基因组时代的必然  11-12
    1.1.2 蛋白质组学的支撑技术  12-16
    1.1.3 蛋白质组学的发展趋势  16-17
  1.2 蛋白质组研究策略的对比：“2D-gel”vs“Shotgun”  17-19
  1.3 蛋白质组研究中的预分离技术  19-20
  1.4 亚细胞蛋白质组学  20-23
    1.4.1 亚细胞蛋白质组学的相关技术及进展  21-22
    1.4.2 细胞核蛋白质组学  22-23
  1.5 定量蛋白质组学  23-26
    1.5.1 定量蛋白质组的相关技术  24-25
    1.5.2 蛋白酶解过程的~(18)O标记  25-26
  1.6 蛋白质组与肿瘤的诊断和治疗  26-28
    1.6.1 阐释肿瘤发生与发展的分子机制  26-27
    1.6.2 分子标志物的寻找与药物分子靶标的预测  27-28
  1.7 本课题的研究意义和研究内容  28-29
    1.7.1 研究意义  28
    1.7.2 研究内容  28-29
第二章 2D LC-MS/MS 蛋白质组研究方法的建立  29-40
  2.1 引言  29
  2.2 材料与方法  29-33
    2.2.1 主要仪器  29-30
    2.2.2 主要试剂  30
    2.2.3 蛋白浓度的测定  30
    2.2.4 标准蛋白的胰蛋白酶溶液酶解  30-31
    2.2.5 已知蛋白混合物的胰蛋白酶溶液酶解  31
    2.2.6 肽混合物的二维液相色谱串联质谱（2D LC-MS/MS）分析  31-32
    2.2.7 质谱数据处理与蛋白的搜索鉴定  32-33
  2.3 结果与讨论  33-38
    2.3.1 蛋白的溶液内酶解  33-34
    2.3.2 标准蛋白的2D LC-MS/MS 分析与鉴定  34-37
    2.3.3 已知蛋白混合物的2D LC MS/MS 分离鉴定  37-38
  2.4 小结  38-40
第三章基于“shotgun”研究策略探讨抗生素生物合成途径  40-60
  3.1 引言  40
  3.2 材料与方法  40-45
    3.2.1 主要仪器与试剂  40-41
    3.2.2 菌种及培养条件  41-42
    3.2.3 菌体总蛋白的提取与胰蛋白酶溶液酶解  42-43
    3.2.4 肽混合物的2D LC-MS/MS 分析与鉴定  43-44
    3.2.5 鉴定蛋白的生物信息学统计分析  44-45
  3.3 结果与讨论  45-59
    3.3.1 菌体总蛋白提取方法的选择  45
    3.3.2 分离与过滤条件对2D LC MS/MS 分析结果的影响  45-48
    3.3.3 鉴定蛋白的理化性质与亚细胞定位分析  48-51
    3.3.4 鉴定蛋白的功能分析  51-55
    3.3.5 抗生素合成相关酶类分析及对合成途径的启示  55-59
  3.4 小结  59-60
第四章基于预分离策略预测白血病细胞系k562 生物标志物  60-83
  4.1 引言  60-61
  4.2 材料与方法  61-65
    4.2.1 主要仪器与试剂  61-62
    4.2.2 细胞系与细胞培养  62-63
    4.2.3 细胞总蛋白的提取与溶液酶解  63
    4.2.4 细胞总蛋白SDS-PAGE 分离与胶内酶解  63-64
    4.2.5 酶解产物的分离鉴定与生物信息学分析  64-65
  4.3 结果与讨论  65-82
    4.3.1 SDS-PAGE 预分离策略与“shotgun”策略的对比  65-67
    4.3.2 鉴定蛋白的理化性质分析  67-69
    4.3.3 蛋白表达基因来源染色体分布  69
    4.3.4 GO 注释  69-75
    4.3.5 与肿瘤相关蛋白分析及生物标志物和药物靶标的预测  75-82
  4.4 小结  82-83
第五章亚细胞水平上k562 核蛋白表达谱的构建及生物学分析  83-100
  5.1 引言  83
  5.2 材料与方法  83-86
    5.2.1 主要仪器和试剂  83-84
    5.2.2 细胞核蛋白的提取与纯度检测  84-85
    5.2.3 细胞核蛋白分离与胶内酶解  85
    5.2.4 肽混合物的分离鉴定与统计分析  85-86
  5.3 结果与讨论  86-99
    5.3.1 核蛋白分离提取效果评价  86
    5.3.2 蛋白的鉴定与理化性质分析  86-89
    5.3.3 蛋白表达基因来源染色体分布  89-90
    5.3.4 蛋白功能参与生物过程及定位的GO 预测  90-95
    5.3.5 与肿瘤相关蛋白分析  95-99
  5.4 小结  99-100
第六章多烯紫杉醇诱导k562细胞凋亡过程中可溶性蛋白表达变化的定量分析  100-113
  6.1 引言  100
  6.2 材料与方法  100-102
    6.2.1 主要仪器和试剂  100-101
    6.2.2 药物处理及细胞总蛋白的提取  101
    6.2.3 细胞蛋白提取物的胰蛋白酶酶解与~(18)O 标记  101
    6.2.4 标记产物的分析鉴定  101
    6.2.5 肽段的定量分析比较  101-102
    6.2.6 差异蛋白的生物学意义探讨  102
  6.3 结果与讨论  102-111
    6.3.1 肽段峰面积比值的计算及方法评价  102
    6.3.2 肽段比值范围的确定  102-106
    6.3.3 可溶性蛋白质组的变化及生物学意义分析  106-111
  6.4 小结  111-113
第七章结论与展望  113-116
  7.1 结论  113-114
  7.2 创新点  114-115
  7.3 展望  115-116
参考文献  116-132
发表论文及参加科研情况  132-133
附录  133-140
致谢  140

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