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从胶州湾海洋放线菌中发现的新型星形孢菌素等7种新结构化合物

作　者: 吴少杰
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 胶州湾 海洋微生物 放线菌 生物活性 化学筛选 次级代谢产物 星形孢菌素 倍半萜 分类 16S rDNA
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


本课题组自1999年以来,将培养条件优化、生物活性跟踪及化学跟踪技术应用到胶州湾海洋放线菌的次级代谢产物研究中,发现了一批具有生物活性的新结构化合物。本研究从青岛胶州湾分离出各类海洋微生物423株,包括海洋放线菌287株,海洋细菌116株,海洋真菌20株,对胶州湾海洋微生物的资源和分布规律有了基本的认识。对其中海洋放线菌的次级代谢产物进行了活性和化学筛选,获得了它们对八种病原微生物的抑制活性数据。发现胶州湾海洋放线菌对至少一种受试微生物具有中等以上拮抗能力的比例为50%。从三株海洋放线菌的发酵粗提物中鉴定出7个新结构化合物和31个已知化合物。具体是:①从菌株M518中鉴定出21个化合物,包括3个新结构天然化合物:N-Foramidostaurosporine,5,7-Dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-1H-azocin-2-one,Selina-4(14),7(11)-diene-8,9-diol和1个新结构衍生物Trimer 3。其中化合物5,7-Dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-1H-azocin-2-one为新骨架类型的天然化合物。②从菌株M491中鉴定出10个化合物,包括3个新结构化合物10α-14-Dihydroxyamorph-4-en-3-one , 10α,11-Dihydroxyamorph-4-ene ,5α,10α,11-Triydroxyamorphan-3-one ;并首次从微生物中分离得到已知化合物10α-Hydroxyamorph-4-en-3-one;③从菌株M311中鉴定出7个已知化合物。发现天然化合物5,7-Dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-1H-azocin-2-one很容易发生重排反应,分离出了两个重排反应产物,并得出该化合物可能的重排反应过程及三聚体形成的方式。生物活性实验结果表明新型星形孢菌素N-Formamidostaurosporine具有很强的抗肿瘤活性:对于37株人类肿瘤细胞的平均IC50,IC70和IC90分别为0.016μg/ml,0.171μg/ml和2.352μg/ml。对37株肿瘤细胞株的抗肿瘤选择性为27%。还首次发现Staurosporine类化合物具有抑制微藻生长的活性。对产生新化合物的菌株M518和M491进行了形态、生理生化及分子鉴定,提交两株菌的16S rDNA序列到GenBank(DQ184649和DQ184648)。结合形态、生理生化特征及系统发育树分析表明:菌株M518属于链霉菌属,并可能属于该属中的粉红孢类群;菌株M491属于链霉菌属,并可能属于该属中的青色类群。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-15
第一章 文献综述  15-38
  第一节 海洋微生物及其生物多样性  15-20
    1.1.1 什么是海洋微生物  15-16
    1.1.2 海洋微生物的生物多样性  16-17
    1.1.3 海洋微生物多样性与分类学研究方法  17-20
      1.1.3.1 传统方法  17-18
      1.1.3.2 分子生物学方法  18-19
      1.1.3.3 海洋微生物的多相分类法  19-20
  第二节 海洋放线菌次级代谢产物研究概况  20-27
    1.2.1 海洋放线菌产次级代谢产物研究概况  21-27
      1.2.1.1 抗肿瘤化合物  21-22
      1.2.1.2 抗菌化合物  22-24
      1.2.1.3 作用于遗传物质的化合物  24-25
      1.2.1.4 酶抑制剂  25-26
      1.2.1.5 其他活性化合物  26-27
  第三节 海洋微生物活性物质研究的新技术  27-36
    1.3.1 去重复  27-30
      1.3.1.1 遗传学去重复  27-28
      1.3.1.2 化学去重复  28-30
    1.3.2 海洋微生物次级代谢产物的分离纯化新技术  30-33
      1.3.2.1 固相萃取技术  30
      1.3.2.2 超临界流体萃取（SFE）与超临界流体色谱（SFC）  30-31
      1.3.2.3 高速逆流色谱  31-32
      1.3.2.4 高效毛细管电泳色谱技术  32-33
    1.3.3 海洋微生物次级代谢产物的结构鉴定  33-36
      1.3.3.1 紫外和可见光谱  33-34
      1.3.3.2 红外光谱  34
      1.3.3.3 质谱  34
      1.3.3.4 核磁共振  34-36
  第四节 本研究的意义和主要内容  36-38
第二章 海洋微生物菌种分离与菌种库的建立  38-42
  第一节 材料与方法  38-41
    2.1.1 仪器设备  38
    2.1.2 样品的采集与处理  38
    2.1.3 海洋微生物的分离（平板涂布法）  38-39
    2.1.4 海洋微生物的纯化  39-40
    2.1.5 菌种保藏  40-41
  第二节 结果与讨论  41-42
第三章 海洋放线菌次级代谢产物的活性与化学筛选  42-57
  第一节 设备与材料  42-44
    3.1.1 主要仪器设备  42
    3.1.2 菌株  42
    3.1.3 培养基  42-44
    3.1.4 显色剂与薄层层析板  44
  第二节 实验方法  44-45
    3.2.1 抗菌活性筛选  44-45
    3.2.2 海洋放线菌次级代谢产物的化学筛选（薄层层析法）  45
  第三节 实验结果  45-55
    3.3.1 活性筛选的结果  45-52
    3.3.2 化学筛选结果  52-55
  第四节 讨论  55-57
    3.4.1 胶州湾海洋放线菌抗微生物活性  55-56
    3.4.2 海洋放线菌次级代谢产物的化学筛选  56-57
第四章 海洋链霉菌M518 次级代谢产物研究  57-81
  第一节 前言  57
  第二节 化合物结构与解析  57-70
    4.2.1 星形孢菌素（Staurosporine，ST）及其衍生物  57-59
    4.2.2 倍半萜  59-61
    4.2.3 (Z)-5,7-dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydroazocin-2(1H)-one 及其衍生物  61-65
    4.2.4 已知化合物  65-70
      4.2.4.1 吲哚类化合物  65-67
      4.2.4.2 Celastramycin B(17)  67-68
      4.2.4.3 Chartreusin A(18)  68-69
      4.2.4.4 其它化合物  69-70
  第三节 实验部分  70-75
    4.3.1 设备与材料  70-72
    4.3.2 试验方法和流程  72-75
      4.3.2.1 发酵与粗提  72
      4.3.2.2 分离纯化与结构鉴定  72-74
      4.3.2.3 化合物4 的人工合成  74-75
  第四节 化合物波谱学数据  75-81
    4.4.1 新化合物波谱学数据  75-76
    4.4.2 已知化合物波谱学数据  76-81
第五章 海洋链霉菌M491 次级代谢产物研究  81-93
  第一节 前言  81
  第二节 化合物结构解析  81-88
    5.2.1 倍半萜类化合物  81-86
    5.2.2 已知化合物  86-88
      5.2.2.1 Prunetin 和Genistein  86
      5.2.2.2 Chalcomycin A  86-87
      5.2.2.3 其它化合物  87-88
  第三节 实验部分  88-90
    5.3.1 设备与材料  88
    5.3.2 实验方法  88-90
      5.3.2.1 发酵与粗提  88
      5.3.2.2 分离纯化与结构鉴定  88-90
  第四节 化合物波谱数据  90-93
    5.4.1 新化合物  90-91
    5.4.2 已知化合物  91-93
第六章 海洋放线菌M311 次级代谢产物研究  93-98
  第一节 前言  93
  第二节 化合物结构解析  93-95
    6.2.1 含氮化合物  93-94
    6.2.2 酚类化合物  94-95
  第三节 实验部分  95-96
    6.3.1 主要设备  95
    6.3.2 实验方法  95-96
      6.3.2.1 发酵和粗提  95
      6.3.2.2 分离纯化和结构鉴定  95-96
  第四节 化合物波谱学数据  96-98
第七章 化合物活性测定  98-104
  第一节 材料与方法  98-100
    7.1.1 实验材料  98-99
    7.1.2 实验方法  99-100
      7.1.2.1 抗微生物活性  99-100
      7.1.2.2 抗肿瘤活性筛选  100
  第二节 活性测试结果  100-102
    7.2.1 抗微生物活性  100-101
    7.2.2 抗肿瘤活性  101-102
  第三节 讨论  102-104
第八章 两株产新化合物菌株的形态、生理生化特征及分子鉴定  104-122
  第一节 形态学和生理生化鉴定  104-110
    8.1.1 设备与材料  104
    8.1.2 形态学鉴定试验方法  104-105
      8.1.2.1 培养形态观察  104-105
      8.1.2.2 电镜形态观察  105
    8.1.3 生理生化鉴定实验方法  105-108
    8.1.4 实验结果  108-110
      8.1.4.1 形态鉴定  108-109
      8.1.4.2 生理生化鉴定  109-110
  第二节 分子生物学鉴定  110-118
    8.2.1 设备与材料  110-111
    8.2.2 实验方法  111-114
      8.2.2.1 基因组DNA的小量提取  111
      8.2.2.2 PCR 扩增  111-112
      8.2.2.3 PCR 产物回收  112
      8.2.2.4 TA 克隆及阳性克隆验证  112-114
      8.2.2.5 测序  114
    8.2.3 序列比对及系统进化树的构建  114
    8.2.4 实验结果  114-118
      8.2.4.1 16S rDNA PCR扩增结果  114
      8.2.4.2 测序结果  114-115
      8.2.4.3 系统进化分析  115-118
      8.2.4.4 两株菌的系统进化树  118
  第三节 讨论  118-122
第九章 主要结论与成果  122-123
致谢  123-124
已发表和已提交的论文  124-125
附录I 化合物抗肿瘤活性测试结果  125-132
参考文献  132-139

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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