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应用噬菌体抗体库技术研制抗肿瘤侵袭与转移单链抗体及烯二炔抗肿瘤抗生素单克隆抗体的建立与初步应用

作　者: 周春水
导　师: 甄永苏
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物药学
关键词: 胶原酶单克隆抗体重组噬菌体胞内抗体辅助噬菌体基底膜抗体库基质金属蛋白酶亲和力发色团
分类号: R73-3
类　型: 博士论文
年　份: 1997年
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内容摘要

侵袭与转移是恶性肿瘤的重要特征，是引起肿瘤病人死亡的主要原因。在肿瘤侵袭与转移过程中，需要多次侵袭基底膜，（1）：穿过基底膜进入基质；（2）：穿过内皮基底膜进入血道或淋巴道；（3）：到达远隔部位的肿瘤细胞穿过内皮基底膜进入基质，形成转移瘤。基底膜是以Ⅳ型胶原为骨架，由层粘连蛋白，纤维粘连蛋白，接触蛋白等组成的膜状结构。Ⅳ型胶原酶是降解Ⅳ型胶原的主要蛋白酶，它属于基质金属蛋白酶（MMP）家族，根据分子量可分为72kDa／MMP-2及92kDa／MMP-9两型，其编码基因具有部分同源性，均以原酶形式分泌于细胞外，需要Zn²⁺辅助激活。在不同组织类型的恶性肿瘤中，MMP-2及MMP-9均有不同程度的表达及活性增高，表明Ⅳ型胶原酶活性与肿瘤细胞的侵袭能力成正相关。研究证实胶原酶抑制剂能减少小鼠Lewis肺癌转移灶的形成，降低癌组织中血管内皮细胞的侵袭力与血管新形成。因此利用特异性抗Ⅳ型胶原酶抗体是阻断肿瘤侵袭与转移的新途径。为克服鼠源性单抗在抗肿瘤应用中存在的免疫源性高、分子量大、组织穿透力差等缺点，本研究在已建立的小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤基础上，采用噬菌体抗体库技术构建、克隆表达抗MMP-9单链抗体。收集5x10⁶个对数生长期抗Ⅳ型胶原酶92kDa小鼠杂交瘤M97细胞，提取mRNA，逆转录合成cDNA第一链，RT-PCR扩增出抗体重链可变区V_H和轻链可变区V_L。取纯化V_H、V_L，各50ng，加入1inker引物，以94℃变性50s，63℃退火并延伸1min，运行10循环组装成单链抗体基因scFv，再加入RS引物二次PCR，以在scFv基因5′、3′端加上Sfi Ⅰ及Not Ⅰ酶切位点。纯化的二次PCR产物经Sfi Ⅰ及Not Ⅰ酶切后插入噬菌体载体pCANTAB 5E，转化E coli. TG1感受态细胞，向对数生长期TG1转化细胞中加入3x10¹⁰ pfu M13K07辅助噬菌体援助重组噬菌体，建成重组噬菌体抗体库，涂板法测定库滴度为5x10⁹pfu／ml.包被10ug／mlⅣ型胶原酶于细胞培养皿内，1％BSA封闭，加入重组噬菌体上清，对其进行一轮筛选与富集，随机选择再感染的TG1菌落扩增培养，并分别用M13K07辅助噬菌体再援救，取上清进行ELISA测定，选择对Ⅳ型胶原酶亲合力高的菌株提取质粒测定其基因序列，结果显示抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因(scFv-

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
缩略词表  12-14
第一部分抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFv-M97基因构建克隆及可溶性表达  14-61
  前言  14-22
  1．单链抗体scFv基因构建  22-25
    (1) 小鼠杂交瘤M-97的培养与鉴定  22-23
    (2) 总RNA的提取与mRNA的纯化  23
    (3) RT-PCR扩增V_H、V_L基因  23-24
    (4) scFv基因的组装与二次PCR  24-25
  2．scFv基因克隆与重组噬菌体的富集与筛选  25-27
    (1) 重组噬菌粒表达载体的构建  25-26
    (2) 重组pCANTAB5E转化大肠杆菌TG1  26
    (3) 重组噬菌体抗体库的建立与抗原固相化富集筛选  26-27
    (4) ELISA鉴定抗原结合阳性重组噬菌体  27
  3．抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因序列分析  27-28
    (1) 重组质粒的提取纯化与鉴定  27-28
    (2) 双脱氧末端终止法测序  28
  4．scFv-M97的可溶性表达  28-31
    (1) 阳性重组噬菌体转染HB2151细胞  28
    (2) 免疫印迹鉴定表达产物  28-30
    (3) 表达产物的免疫活性及特异性分析  30-31
  5．亲和层析纯化单链抗体scFv-M97  31-32
    (1) 亲和柱制备与亲和层析  31
    (2) SDS-PAGE鉴定纯化产物  31-32
  结果与讨论  32-58
  小结  58-61
第二部分单抗M-97对肿瘤细胞生物学影响的研究  61-79
  前言  61-63
  1．Zymography测定单抗M-97对Lewis肺癌、HT1080细胞酶谱影响  63-64
  2．MTT法测定单抗M-97对HT1080细胞粘附能力的影响  64-65
  结果  65-74
  讨论  74-77
  小结  77-79
第三部分烯二炔抗肿瘤抗生素单克隆抗体的建立与初步应用  79-109
  前言  79
  材料  79-83
  方法  83-88
  结果  88-104
  讨论  104-106
  小结  106-109
论文综述(一) 第三代抗体工程技术研究与应用的新进展  109-125
  1．噬菌体抗体库技术  109-114
  2．体外亲和力成熟技术  114-115
  3．转基因抗体  115-120
  4．胞内抗体技术及医学应用  120-125
论文综述(二) 基质金属蛋白酶及抑制剂在肿瘤侵袭转移中的研究  125-138
  1．MMPs家族  125-129
  2．Ⅳ型胶原酶  129-131
  3．TIMP与肿瘤  131-132
  4．以MMPs为靶点的抗肿瘤药物  132-138
致谢  138

应用噬菌体抗体库技术研制抗肿瘤侵袭与转移单链抗体及烯二炔抗肿瘤抗生素单克隆抗体的建立与初步应用

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