学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

牙鲆eIF2α激酶基因HRI和PKR的克隆、表达及功能分析

作　者: 朱蓉
导　师: 桂建芳
学　校: 中国科学院研究生院（水生生物研究所）
专　业: 遗传学
关键词: eIF2α激酶血红素调节抑制因子(HRI) dsRNA依赖的蛋白激酶(PKR) 草鱼出血病病毒(GCHV) 大菱鲆弹状病毒(SMRV) 牙鲆囊胚培养细胞(FEC) 诱导表达功能分析抗病毒反应翻译抑制
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 273次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

当真核细胞面临各种外界压力时,可通过磷酸化真核翻译起始因子eIF2α的Ser51位点来调节蛋白的合成。目前发现了四种磷酸化eIF2α的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,分别是HRI(the heme-regulated initiation factor 2αkinase)、PKR(the interferon inducible double-stranded RNA dependent protein kinase)、GCN2(the general control nonderepressible 2)和PERK(the endoplasmic reticulum-resident kinase)。本研究通过构建紫外灭活的草鱼出血病病毒(grass carp hemorrhage virus, GCHV)诱导的牙鲆囊胚培养细胞(flounder (Paralichthys olivaceus) embryonic cells,FEC)的SMART cDNA文库,运用同源克隆法,成功克隆鉴定了牙鲆的两个eIF2α激酶基因PoHRI(Paralichthys olivaceus HRI)和PoPKR,表达特征和初步功能分析揭示PoHRI和PoPKR在牙鲆的抗病毒免疫反应中可能发挥翻译抑制功能。PoHRI是成功克隆的第一个鱼类HRI基因,全长cDNA序列为2391bp,编码651aa。结构上,PoHRI与已知HRI蛋白具有高度同源性,C端包含12个保守的eIF2α激酶催化亚区,IV和V区之间有一段长136aa的激酶间区,并具有相对保守的N端区域(NTD)。体外诱导研究表明,热休克、病毒感染和PolyI:C都能诱导FEC细胞中的PoHRI mRNA的上调表达,但不同压力下PoHRI的表达模式不同。原核表达特异于PoHRI的N端1-200氨基酸的融合多肽,免疫小鼠成功获得抗PoHRI抗体血清,western blot分析揭示不同压力下PoHRI蛋白呈现与mRNA一致的上调表达模式。体内研究证明PoHRI在牙鲆组织中是一种遍在表达的激酶,可能不仅仅是一种血红素依赖的eIF2α激酶。人工感染大菱鲆弹状病毒(scophthalmus maximus rhabdovirus,SMRV)发现PoHRI在牙鲆相应组织的表达明显上调。PoHRI的病毒诱导特征暗示其可能在抗病毒免疫反应中发挥蛋白翻译抑制或某种未知功能。PoPKR全长cDNA序列为2596bp,编码688aa。推导的PoPKR蛋白具有哺乳类PKR的保守结构域,包括N端的两个dsRNA结合区(dsRNA-binding motifs,dsRBMs),dsRBM1和dsRBM2,以及C端由12个保守的催化亚区组成的激酶区。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
缩略语表  9-15
第一章文献综述  15-42
  1.1 eIF2α激酶家族  15-23
    1.1.1 eIF2α激酶的作用机制  15-17
    1.1.2 eIF2α激酶的结构特征  17-18
    1.1.3 eIF2α激酶的调节  18-20
    1.1.4 可能存在的其它eIF2α激酶  20-21
    1.1.5 eIF2α激酶的抑制子  21-22
    1.1.6 eIF2α激酶的其它作用  22-23
  1.2 HRI 基因的研究进展  23-27
    1.2.1 HRI 的结构特点  23-24
    1.2.2 HRI 的调节  24-25
      1.2.2.1 血红素对HRI 的调节  24
      1.2.2.2 热休克蛋白对HRI 的调节  24-25
    1.2.3 HRI 的组织分布  25-26
    1.2.4 HRI 的功能  26-27
  1.3 PKR 基因的研究进展  27-39
    1.3.1 PKR 的结构特点  27-33
      1.3.1.1 PKR 的N端  27-31
      1.3.1.2 PKR 的C 端  31
      1.3.1.3 中心区－磷酸化区域  31
      1.3.1.4 PKR 的启动子  31-33
    1.3.2 PKR 的合成与降解  33-34
    1.3.3 PKR 的功能  34-39
      1.3.3.1 PKR 的抗病毒功能  36
      1.3.3.2 PKR 能抑制肿瘤  36-37
      1.3.3.3 PKR 调节细胞增殖和分化  37
      1.3.3.4 PKR 在细胞凋亡中的作用  37-38
      1.3.3.5 PKR 在信号转导中的作用  38
      1.3.3.6 PKR 在转录调控中的作用  38-39
  1.4 鱼类eIF2α激酶  39-40
  1.5 本研究的目的和意义  40-42
第二章材料和方法  42-68
  2.1 实验材料  42
    2.1.1 牙鲆  42
    2.1.2 细胞和病毒  42
  2.2 主要仪器设备  42-44
  2.3 试剂  44-48
    2.3.1 试剂盒  44
    2.3.2 主要试剂  44-46
      2.3.2.1 生化与分子生物学试剂  44-45
      2.3.2.2 细胞培养常用试剂  45-46
    2.3.3 载体和菌株  46-47
    2.3.4 引物  47-48
  2.4 实验方法  48-68
    2.4.1 细胞培养  48-50
      2.4.1.1 细胞培养及传代  48-49
      2.4.1.2 细胞株的保藏  49
      2.4.1.3 冻存细胞的复苏  49-50
    2.4.2 病毒增殖、纯化和紫外灭活  50-51
      2.4.2.1 病毒的增殖  50
      2.4.2.2 病毒的纯化  50-51
      2.4.2.3 紫外灭活病毒  51
    2.4.3 SMART cDNA 的合成  51-54
      2.4.3.1 病毒诱导的FEC 细胞的制备  51
      2.4.3.2 病毒诱导和对照FEC 细胞总RNA 的提取  51-52
      2.4.3.3 SMART cDNA 的合成  52-54
    2.4.4 RACE-PCR 克隆全长基因及序列分析  54-56
      2.4.4.1 RACE-PCR 克隆全长基因  54-55
      2.4.4.2 序列分析  55-56
    2.4.5 目的基因的原核表达，纯化及多克隆抗体的制备  56-58
      2.4.5.1 原核表达载体的构建  56
      2.4.5.2 小量诱导筛选阳性克隆  56
      2.4.5.3 大量诱导  56-57
      2.4.5.4 蛋白的纯化  57
      2.4.5.5 多克隆抗体的制备和鉴定  57-58
    2.4.6 RT-PCR 分析  58-60
      2.4.6.1 RNA 的提取  58
      2.4.6.2 逆转录  58-59
      2.4.6.3 荧光定量 PCR  59-60
    2.4.7 Western blot 分析基因的表达  60-61
      2.4.7.1 样品的制备  60-61
      2.4.7.2 Western blotting  61
    2.4.8 目的基因的表达分析  61-62
      2.4.8.1 目的基因的组织特异性表达分析  61-62
      2.4.8.2 目的基因在FEC 细胞中的诱导表达分析  62
      2.4.8.3 目的基因在牙鲆鱼体中的诱导表达分析  62
    2.4.9 PolyI:C pull down 分析  62-63
      2.4.9.1 PolyI:C agarose beads 的制备  62-63
      2.4.9.2 PolyI:C pulldown  63
    2.4.10 PKR 基因抑制翻译的功能分析  63-67
      2.4.10.1 点突变  63-65
      2.4.10.2 瞬时转染  65-66
      2.4.10.3 萤光素酶活性分析  66-67
    2.4.11 eIF2α的磷酸化分析  67-68
      2.4.11.1 FEC 细胞磷酸化蛋白的提取  67
      2.4.11.2 FEC细胞磷酸化蛋白的分析  67-68
第三章结果与分析  68-115
  3.1 PoHRI 基因全长cDNA 的克隆及表达分析  68-87
    3.1.1 PoHRI 基因全长cDNA 的克隆  68-69
    3.1.2 PoHRI 基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析  69-78
    3.1.3 PoHRI 基因的原核表达和多克隆抗体的制备  78-80
    3.1.4 PoHRI 基因的组织表达分析  80-82
    3.1.5 PoHRI 基因在各种细胞压力诱导下的表达  82-85
    3.1.6 SMRV 诱导牙鲆鱼体中PoHRI 基因的表达分析  85-87
  3.2 PoPKR 基因全长cDNA的克隆、表达和功能分析  87-115
    3.2.1 PoPKR 基因全长cDNA 的克隆  87-88
    3.2.2 PoPKR 基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析  88-96
    3.2.3 PoPKR 基因的原核表达和多克隆抗体的制备  96-98
    3.2.4 病毒和Poly I:C 诱导FEC 细胞PoPKR 基因的表达  98-100
    3.2.5 SMRV 诱导牙鲆鱼体中PoPKR 基因的表达分析  100-102
    3.2.6 PoPKR 和PoHRI 受病毒诱导表达的差异  102-105
    3.2.7 PoPKR 蛋白N 端结构域的dsRNA 结合活性分析  105-108
    3.2.8 PoPKR 抑制翻译的功能分析  108-113
    3.2.9 eIF2α的磷酸化分析  113-115
第四章讨论  115-126
  4.1 鱼类存在eIF2α激酶家族  115-118
    4.1.1 鱼类细胞在压力下具有eIF2α磷酸化现象  115-116
    4.1.2 牙鲆HRI 和PKR 基因是哺乳类的同源基因  116-118
  4.2 牙鲆HRI 和PKR 是两种遍在表达的激酶  118-120
    4.2.1 有关HRI的组织分布的争论  118-119
    4.2.2 牙鲆HRI 和PKR 存在本底表达的意义  119-120
  4.3 牙鲆eIF2α激酶功能保守性和特殊性  120-123
    4.3.1 PKR 的各结构域具有类似哺乳类PKR 的功能  120-121
    4.3.2 HRI 在多种压力下的功能  121-122
    4.3.3 PKR 和HRI 在抗病毒免疫中的可能角色  122-123
  4.4 鱼类eIF2α激酶的结构特殊性  123-126
总结  126-127
参考文献  127-142
附录  142-143
  论文发表情况  142-143
致谢  143

牙鲆eIF2α激酶基因HRI和PKR的克隆、表达及功能分析

内容摘要

全文目录

相似论文