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锌及锌源对动物的生长、免疫调节及其分子机制研究

作　者: 虞泽鹏
导　师: 乐国伟；施用晖
学　校: 江南大学
专　业: 粮食、油脂与植物蛋白工程
关键词: 硫酸锌蛋氨酸锌生长免疫基因表达抗氧化凋亡小鼠肉用仔鸡
分类号: S816
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

锌是动物的一种必需微量元素,对维持动物生长、发育和免疫功能起着重要的作用。氨基酸螯合锌是锌同氨基酸按一定摩尔比以共价键结合而成有机微量元素螯合物;有研究表明其能有效促进动物生长和提高机体免疫;亦有研究认为两者被动物吸收后在体内的代谢不同。本课题采用肉用仔鸡和小鼠作为试验对象,选用蛋氨酸锌（zinc methionine,Zn-Met）和硫酸锌（ZnSO₄）两种锌源研究两者对动物生长、免疫的调节效果及其分子机制。1.不同锌源对肉用仔鸡早期生长的影响及DDRT-PCR法初步筛选差异表达基因选用1日龄Avine肉用仔鸡75只,随机分为3组（对照组,ZnSO₄组和Zn-Met组）,每组5个重复。测定试鸡生长性能及部分生理生化指标,研究不同锌源对仔鸡早期生长的影响;同时采用银染差异显示技术（differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR）进行差异表达基因的初步筛选。结果表明,基础日粮中添加Zn-Met和ZnSO₄均能有效提高仔鸡生长和改善饲料效率;Zn-Met组效果优于ZnSO₄组。添加锌能提高胫骨、胰脏中锌含量;Zn-Met组锌增加幅度高于ZnSO₄组。血清锌含量及血清AKP活性三组间无显著差异。试验采用银染差异显示法对受不同锌源影响肝脏基因进行了初步筛选,回收差异条带26条;对其中两个差异条带进行亚克隆,成功获取一个阳性克隆。2.不同锌源对断乳小鼠早期生长的影响及其机制选取21d断奶雄性小鼠（KM种）90只,随机分为3组,每组设3个重复,采用玉米淀粉—酪蛋白半纯合日粮基础日粮（含锌11.67mg/kg）。对照组饲喂基础日粮,硫酸锌组、蛋氨酸锌组分别在基础日粮中添加ZnSO₄、Zn-Met 30mg/kg（以锌计）;测定小鼠体重、组织锌含量、血清AKP活性、血浆生长激素（GH）含量、肝脏生长激素受体（GHR）及胰岛素样生长因子I（IGF-I）mRNA表达水平。结果表明,两种形式锌均能有效提高小鼠体重（P<0.05）;蛋氨酸锌促长效果优于硫酸锌,在饲养前期尤为显著（P<0.05）。两种锌源均能提高肝脏、血清锌含量及血清AKP活性;蛋氨酸锌处理组织锌含量增加幅度略高于硫酸锌处理（P>0.05）。两种锌源对GH水平、GHR基因表达无显著影响（P>0.05）;均能显著提高IGF-I基因表达水平（P<0.05）。与ZnSO₄相比,Zn-Met更大幅度地提高IGF-I mRNA表达（P<0.05）,从而有效地促进小鼠生长（P<0.05）。3.不同锌源吸收、转运及调节机制研究选用21d断奶雄性小鼠为研究对象,半定量RT-PCR法测定小肠ZnT1（zinctransporter,ZnT）、ZnT4、DCT1（divalent cation transporter,DCT）、小肠及肝脏MT-1（metallothionein,MT）mRNA表达量。结果表明,Zn-Met、ZnSO₄处理显著降低ZnT1、ZnT4、DCT1 mRNA表达量（P<0.05）;Zn-Met组ZnT1、DCT1 mRNA表达量均显著低于ZnSO₄组（P<0.05）;两种锌处理间ZnT4 mRNA表达量无明显差异（P>0.05）。小鼠肝脏、小肠MT-1 mRNA表达量均为Control<ZnSO₄<Zn-Met（P<0.05）。上述结果表

全文目录

摘要  9-12
ABSTRACT  12-16
英文缩写一览表  16-17
第1章绪论  17-34
  1.1 前言  17
  1.2 锌的生物学功能及其研究进展  17-22
    1.2.1 维持酶的活性和功能  17
    1.2.2 维持生物膜的正常结构与功能  17
    1.2.3 调节机体内分泌  17-18
    1.2.4 调控基因表达  18-19
    1.2.5 维持机体免疫功能  19-22
      1.2.5.1 锌对免疫细胞功能的影响  19-20
      1.2.5.2 锌对免疫细胞生成的影响  20
      1.2.5.3 锌对细胞凋亡的调节作用  20-21
      1.2.5.4 锌调节细胞凋亡的可能机制  21-22
  1.3 锌添加剂的种类  22
  1.4 锌添加剂的营养研究进展  22-24
  1.5 锌的吸收与代谢  24-27
    1.5.1 无机锌的吸收  24
    1.5.2 氨基酸螯合锌的吸收  24-25
    1.5.3 锌的代谢与稳衡调控  25-27
  1.6 立题意义与本课题主要研究内容  27-34
第2章不同锌源对肉用仔鸡早期生长的影响及DDRT-PCR 法初步筛选差异表达基因  34-45
  2.1 前言  34
  2.2 材料与方法  34-39
    2.2.1 主要试剂  34-35
    2.2.2 试验仪器  35
    2.2.3 试验方案  35
    2.2.4 试验动物  35-36
    2.2.5 试验日粮  36
    2.2.6 测定项目与方法  36-38
    2.2.7 数据处理  38-39
  2.3 结果分析  39-42
    2.3.1 不同锌源对肉用仔鸡体重的影响  39
    2.3.2 不同锌源对料重比的影响  39
    2.3.3 不同锌源对肉仔鸡组织锌含量及血清AKP 活性的影响  39-40
    2.3.4 RNA 提取及完整性鉴定  40
    2.3.5 差异条带的回收及二次PCR 扩增  40-42
    2.3.6 亚克隆及酶切鉴定  42
  2.4 讨论  42-43
  2.5 小结  43-45
第3 章不同锌源对断乳小鼠早期生长的影响及其机制  45-55
  3.1 前言  45-46
  3.2 材料与方法  46-49
    3.2.1 主要试剂  46
    3.2.2 试验仪器  46-47
    3.2.3 试验动物与日粮  47
    3.2.4 测定项目及方法  47-49
    3.2.5 数据处理  49
  3.3 结果分析  49-52
    3.3.1 不同锌源对小鼠体重的影响  49
    3.3.2 不同锌源对肝脏、血清锌含量及AKP 活性的影响  49-50
    3.3.3 不同锌源对小鼠血浆生长激素水平的影响  50
    3.3.4 不同锌源对生长激素受体(GHR)mRNA 表达量的影响  50-51
    3.3.5 不同锌源对IGF-I mRNA 表达量的影响  51-52
  3.4 讨论  52-53
    3.4.1 不同锌源对小鼠生长及组织锌含量的影响  52
    3.4.2 不同锌源对GH、IGF-I mRNA 表达量的影响  52-53
  3.5 小结  53-55
第4章不同锌源吸收、转运及调节机制研究  55-69
  4.1 前言  55
  4.2 材料与方法  55-57
    4.2.1 主要试剂  55-56
    4.2.2 试验仪器  56
    4.2.3 试验动物与日粮  56
    4.2.4 逆转录PCR(RT-PCR)  56-57
  4.3 结果分析  57-61
    4.3.1 不同锌源对ZnT1 mRNA 表达量的影响  57-58
    4.3.2 不同锌源对ZnT4 mRNA 表达量的影响  58-59
    4.3.3 不同锌源对DCT1 mRNA 表达量的影响  59-60
    4.3.4 不同锌源对肠道MT-1 mRNA 表达量的影响  60
    4.3.5 不同锌源对肝脏MT-1 mRNA 表达量的影响  60-61
  4.4 讨论  61-66
    4.4.1 锌对ZnT1、ZnT4 mRNA 表达量的影响  61-62
    4.4.2 锌对DCT1 mRNA 表达量的影响  62-63
    4.4.3 锌对MT-1 mRNA 表达量的影响  63-64
    4.4.4 蛋氨基酸锌吸收、转运机制  64
    4.4.5 不同锌源的肠道转运及调控模型  64-66
  4.5 小结  66-69
第5章不同锌源对小鼠免疫功能的影响及其机制研究  69-79
  5.1 前言  69
  5.2 材料与方法  69-72
    5.2.1 主要试剂  69
    5.2.2 试验仪器  69-70
    5.2.3 试验动物  70
    5.2.4 试验日粮  70
    5.2.5 测定项目与方法  70-72
    5.2.6 数据处理  72
  5.3 结果分析  72-74
    5.3.1 不同锌源对脏器指数的影响  72-73
    5.3.2 不同锌源对ANAE~+、脾脏SI 的影响  73
    5.3.3 不同锌源对血清白介素活性的影响  73-74
    5.3.4 不同锌源对溶血素及免疫球蛋白的影响  74
    5.3.5 不同锌源对血清总蛋白、白蛋白以及球胆白含量的影响  74
  5.4 讨论  74-76
    5.4.1 锌对脏器指数的影响  74-75
    5.4.2 锌对细胞因子含量的影响  75
    5.4.3 锌对ANAE~+及SI 的影响  75-76
    5.4.4 锌对抗体生成的影响  76
    5.4.5 不同锌源对机体免疫功能的影响  76
  5.5 小结  76-79
第6章不同锌源对断奶小鼠机体抗氧化能力的影响  79-86
  6.1 前言  79
  6.2 材料与方法  79-80
    6.2.1 主要试剂  79
    6.2.2 试验仪器  79-80
    6.2.3 试验动物  80
    6.2.4 试验日粮  80
    6.2.5 测定项目及方法  80
    6.2.6 数据处理  80
  6.3 结果分析  80-82
    6.3.1 不同锌源对小鼠血浆丙二醛(MDA)含量的影响  80-81
    6.3.2 不同锌源对总抗氧化能力(T-AOC)的影响  81
    6.3.3 不同锌源对T-SOD 及CuZn-SOD 的影响  81
    6.3.4 不同锌源对NO 和NOS 的影响  81-82
  6.4 讨论  82-83
  6.5 小结  83-86
第7章不同锌源对体外培养胸腺细胞凋亡的影响及其机制研究  86-103
  7.1 前言  86-87
  7.2 材料与方法  87-89
    7.2.1 主要试剂  87
    7.2.2 试验仪器  87-88
    7.2.3 试验处理  88
    7.2.4 测定指标  88-89
    7.2.5 数据处理  89
  7.3 结果分析  89-95
    7.3.1 不同锌源对细胞活力的影响  89-91
    7.3.2 不同锌源对AKP 活性的影响  91-92
    7.3.3 不同锌源对GSH-Px 活性的影响  92
    7.3.4 不同锌源对CuZn-SOD 活性的影响  92-93
    7.3.5 不同锌源对细胞内Ca~(2+)浓度的影响  93-94
    7.3.6 不同锌源对细胞凋亡率的影响  94
    7.3.7 不同锌源对DNA ladder 的影响  94-95
  7.4 讨论  95-98
    7.4.1 细胞活性与细胞凋亡的关系  95-96
    7.4.2 不同锌源对AKP 活性的影响  96
    7.4.3 细胞氧化还原状态与细胞凋亡  96-97
    7.4.4 钙离子浓度对细胞凋亡的影响  97
    7.4.5 锌源及锌水平对细胞凋亡的调节  97-98
  7.5 小结  98-103
第8章不同锌源对细胞凋亡调控的分子机制研究  103-115
  8.1 前言  103
  8.2 材料与方法  103-106
    8.2.1 主要试剂  103-104
    8.2.2 试验仪器  104
    8.2.3 试验处理  104
    8.2.4 流式细胞分析  104
    8.2.5 DNA 片段化检测(DNA Ladder)  104
    8.2.6 逆转录PCR(RT-PCR)  104-105
    8.2.7 数据处理  105-106
  8.3 结果分析  106-109
    8.3.1 不同锌源对细胞凋亡率的影响  106
    8.3.2 不同锌源对DNA 片段化的影响  106-107
    8.3.3 不同锌源对bcl-2 mRNA 表达量的影响  107
    8.3.4 不同锌源对bax mRNA 表达量的影响  107-108
    8.3.5 不同锌源对caspase-3 mRNA 表达量的影响  108-109
  8.4 讨论  109-112
    8.4.1 不同锌源对bcl-2、bax、caspase-3 基因表达的影响  109-111
    8.4.2 不同锌源对细胞凋亡的调控机制  111-112
  8.5 小结  112-115
论文主要结论  115-116
论文主要创新点  116-117
致谢  117-118
博士研究生期间发表(录用)的学术论文  118

锌及锌源对动物的生长、免疫调节及其分子机制研究

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