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犬冠状病毒的流行病学调查及地方株的特性研究

作　者: 王玉燕
导　师: 陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬冠状病毒套式PCR I型CCV II型CCV M基因 S基因基因重组单克隆杭体病毒感染的抗体依赖性增强作用 SARS-CoV 嵌合基因
分类号: S858.292
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

1.自2003年7月至2004年2月的8个月内收集犬粪样138份,其中家庭单养的腹泻犬粪样52份,犬场群养健康犬粪样81份,腹泻粪样5份。用可鉴定基因型的套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV)。结果显示,81份健康犬粪样中有70份检出Ⅱ型CC,各地的检出率差异不大,南京为80.0%(24/30),沈阳为87.2%(34/39),昆明为100%(12/12)。腹泻病犬CCVⅡ型阳性率南京为40.9%(18/43),上海77.8%(7/9),昆明60%(3/5)。各地均没有检测到典型的Ⅰ型CCV。取各地犬CCV阳性样本PCR产物各2份测序,结果表明,所得Ⅱ型CCV序列都与CCV1-71(96.5-99.5%)及来自中国大熊猫CCV(95.8-99.1%)的M基因序列有很高的同源性,与猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)的同源性(93.4-97.2%)高于Ⅰ型猫冠状病毒(FcoV)代表株UCD1(77.8-81.6%)和Ⅱ型FCoV代表株FIPV79-1683(75.9-79.7%)。一个来自昆明的CCV序列在系统进化树上处于Ⅰ和Ⅱ型CCV之间,可能是一个新的变异株。 2.用A72细胞从RT-nPCR检测阳性的腹泻犬粪样中分离CCV,经RT-nPCR和免疫荧光试验鉴定,成功分离到4株CCV野毒,分别命名为CCV KM、NJ2、NJ17、SH3。对CCV KM毒株进行了电镜观察,可见到与CCV参考毒株1-71相似的带“冠”的病毒粒子。细胞适应性试验表明,分离到的野毒在A72细胞上导致的CPE不同于参考毒株的合胞体病变,NJ2、KM株主要导致细胞圆缩、脱落,NJ2株的6-15代在A72细胞上有CPE,但是15代后不再出现CPE。NJ17、SH3在A72细胞上不产生明显的细胞病变(CPE)。参考株CCV1-71及野毒KM、NJ2(8代)都可在A72、MDCK、F81、CrFK等细胞上增殖,只有KM株可在Vero细胞上增殖,并可见明显CPE。交叉保护试验证明,抗KM的血清不能中和其他的CCV毒株,抗CCV1-71的血清可以中和野毒KM、NJ2但是不能中和另外的CCV野毒株HC、DF、HF,说明CCV不同毒株间的交叉保护性很有限。 3.蚀斑克隆纯化CCV1-71株,然后经蔗糖密度梯度离心提纯抗原,免疫BALB/C小鼠,小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,用ELISA方法筛选到一株ELISA效价高的杂交瘤细胞株E1,用中和试验方法筛选到两株有中和抗体作用的杂交瘤细胞株N1、N2。ELISA阳性的杂交瘤细胞分泌抗体在细胞培养上清中的效价可达1:2048,小鼠腹水的效价为1:38768,两中和抗体分泌株的细胞培养上清中抗体的效价分别为1:40、1:80,小鼠腹水效价分别为1:20480、1:40960。单抗的特异性检测表明:免疫荧

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
上篇文献综述  15-51
  第一章犬冠状病毒的研究进展  15-43
  第二章犬冠状病毒的基因重组现象及重组机制假说  43-51
下篇研究内容  51-130
  第三章犬粪样中冠状病毒的检测及基因型分析  51-62
    1．材料与方法  52-53
    2．结果  53-56
    3．讨论  56-59
    参考文献  59-62
  第四章犬冠状病毒的分离鉴定  62-73
    1．材料与方法  62-64
    2．结果  64-69
    3．讨论  69-71
    参考文献  71-73
  第五章犬冠状病毒单克隆抗体的制备  73-84
    1．材料与方法  73-78
    2．结果  78-80
    3．讨论  80-82
    参考文献  82-84
  第六章单克隆抗体对犬冠状病毒释放方式的展示及中和性单抗的ADE性质  84-93
    1．材料与方法  85-86
    2．结果  86-90
    3．讨论  90-91
    参考文献  91-93
  第七章犬冠状病毒M基因的同源重组分析  93-104
    1．材料与方法  94-96
    2．结果  96-100
    3．讨论  100-102
    参考文献  102-104
  第八章犬冠状病毒S基因的同源重组分析  104-120
    1．材料与方法  105-106
    2．结果  106-115
    3．讨论  115-118
    参考文献  118-120
  第九章犬冠状病毒与SARS-CoV嵌合S基因表达载体的构建及初步表达  120-130
    1．材料与方法  120-124
    2．结果  124-127
    3．讨论  127-128
    参考文献  128-130
全文总结  130-131
攻读学位期间发表文章目录  131-132
致谢  132

犬冠状病毒的流行病学调查及地方株的特性研究

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