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利用不同策略获得抗SCMV转基因玉米的研究

作　者: 白云凤
导　师: 王国英
学　校: 中国农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 玉米 转基因 SCMV dsRNA 无标记 双抗
分类号: S513
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 221次
引　用: 2次
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内容摘要


玉米矮花叶病（MDM）是世界性病害,在我国主要由甘蔗花叶病毒（SCMV）的MDB株系（SCMV-MDB）引起。我们通过采用不同的策略,获得了高抗SCMV转基因玉米。先构建了无标记基因的SCMV-MDB复制酶基因NIb的反向重复序列（SCMVirNIb）表达载体pSCMVirNIb。通过冻融法将pSCMVirNIb载体与抗除草剂标记基因（bar）载体分别导入农秆菌LBA4404,然后共转化玉米幼胚。通过除草剂梯度筛选,获得了Z3自交系再生苗,其中14株的标记基因和目的基因PCR扩增均呈阳性,目的基因DNA点杂交亦呈阳性。这14株的自交种子在冬季于温室种T1代株行,人工接种SCMV,抗病株率高于60%的有11个株行。PCR检测抗病株,有一个植株只含有目的基因而无标记基因,即通过有性繁殖过程中的基因分离与重组,在T1代得到了无标记基因的抗病转基因植株。根据T1代植株抗病性鉴定和PCR检测结果,在田间种植了68个T2代株系。在人工接种SCMV条件下,有3个株系的抗病株率高于85%,其中的一个株系来自T1代无标记基因的抗病转基因植株。PCR进一步检测该株系的8个抗病株,均呈标记基因阴性,目的基因阳性。ELISA检测结果,转基因抗病株的OD值与未接病的健康株基本持平。用转基因抗病株叶片汁液回接,回接植株未表现感病症状,而非转基因对照的回接植株均表现感病症状,表明转基因抗病株不含病毒或含毒量很低,抗病性达到高抗甚至免疫水平。 构建了SCMV-MDB的外壳蛋白基因（cp）和改造过的Bt毒蛋白基因（crylacm）的双价表达载体pCr-Cp,农杆菌介导转化玉米自交系Z31,获得了再生苗。根据叶片涂抹除草剂抗性鉴定和cp基因及crylacm基因PCR检测结果,在冬季于温室种植7个T1代株行。对T1代人工接种SCMV,各株行均有抗、感株分离。T2代共种12个株系,人工接病、接虫,鉴定双抗性。结果T2代的12个株系均尚在分离,其中1个株系的双抗株率高于50%。其双抗株的cp基因和crylacm基因PCR检测均呈阳性,Bt毒蛋白试纸条检测,2株的检测线比较明显,表明Bt毒蛋白得到了表达。即获得了兼抗玉米螟的抗SCMV转基因玉米, 构建了无标记基因的SCMV—MDB反义cp基因表达载体pACP,农秆菌共转化玉米自交系Z3的幼胚,得到了再生株。T1代人工接种SCMV,有2个株行的抗病株率高于70%。PCR检测抗病株,其中1个株行有2株cp基因阳性而标记基因阴性,获得了无标记转反义cp基因抗病株。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
缩略词  6-10
第一章 文献综述和立题意义  10-28
  1 标记基因和无标记转基因研究进展  10-18
    1．1 标记基因及其在转化系统中的应用  10
    1．2 标记基因的安全性问题  10-11
    1．3 安全性标记基因  11-13
    1．4 标记基因消除体系  13-18
  2 RNA干扰和作物遗传改良及其抗病毒基因工程  18-23
    2．1 RNA干扰机制  19-20
    2．2 RNA干扰技术  20
    2．3 RNA干扰在作物遗传改良上的应用  20-21
    2．4 RNA干扰在植物抗病毒基因工程中的应用  21-22
    2．5 RNA干扰技术的相关问题  22-23
  3 玉米矮花叶病抗性遗传和抗病基因工程  23-27
    3．1 抗源筛选  24
    3．2 抗性遗传  24-25
    3．3 抗病基因的分子标记和定位  25-26
    3．4 抗病基因工程研究进展  26-27
  4 本研究的目的和意义  27-28
第二章 dsRNA介导高抗SCMV无标记转基因玉米研究  28-57
  1 实验材料  28-34
    1．1 质粒载体、宿主菌和植物材料  28
    1．2 生化试剂  28
    1．3 主要仪器  28
    1．4 PCR引物  28
    1．5 常用培养基和溶液  28-34
  2 实验方法  34-42
    2．1 载体构建及其导入细菌  34-36
    2．2 玉米幼胚转化  36-37
    2．3 转基因分子检测  37-39
    2．4 除草剂叶片涂抹  39
    2．5 玉米SCMV抗性鉴定  39-42
  3 结果和分析  42-55
    3．1 无标记基因的SCMV NIb基因反向重复序列表达载体的构建、鉴定和可形成的dsRNA结构分析  42-44
    3．2 表达载体导入根癌农杆菌及其鉴定  44-45
    3．3 农杆菌介导玉米转化和获得再生植株  45
    3．4 T_0代的除草剂抗性鉴定和转基因的分子检测  45-47
    3．5 T_1代抗病性鉴定和分子检测  47-49
    3．6 T_2代抗病性鉴定和分子检测  49-54
    3．7 T_2代株系与非转基因对照的株高及果穗差异  54-55
  4 讨论  55-57
第三章 病虫双抗转基因玉米研究  57-69
  1 研究背景  57
  2 材料和方法  57-59
  3 结果和分析  59-68
    3．1 双价表达载体的构建及酶切鉴定  59-60
    3．2 双价表达载体导入农杆菌及其鉴定  60
    3．3 玉米幼胚转化和获得再生植株  60-62
    3．4 T_0代除草剂抗性鉴定和转基因分子检测  62
    3．5 T_1代抗病性鉴定和PCR检测  62-63
    3．6 T_2代双抗性鉴定和分子检测  63-65
    3．7 除草剂发芽筛选对提高转基因株率的作用  65-67
    3．8 转基因后代的一些变异  67-68
  4 讨论  68-69
第四章 反义RNA介导抗SCMV无标记转基因玉米研究  69-76
  1 材料和方法  69
  2 结果和分析  69-74
  3 讨论  74-76
第五章 农杆菌介导玉米转基因过程中的一些影响因素  76-80
  1 材料和方法  76
  2 结果和分析  76-79
  3 小结和讨论  79-80
第六章 结论  80-81
参考文献  81-87
致谢  87

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米（玉蜀黍）
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