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磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究

作　者: 周大利
导　师: 郑昌琼
学　校: 四川大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 骨组织工程骨髓基质干细胞骨形态发生蛋白重组人的骨形成蛋白-2 生物复合材料磷酸钙生物活性骨水泥聚L-乳酸 β-磷酸三钙 α-磷酸三钙
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

骨组织工程复合材料至少包括两个最重要的组成部分：支架材料和种子细胞（或者因子）。种子细胞通过体外和体内增殖、分化和分泌胞外基质构建新的骨组织，骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）能够异位诱导间充质细胞分化为软骨和骨细胞，支架材料提供新骨组织形成所需的临时空间和力学支持。因此种子细胞及因子的选择、扩增和支架材料的研制是骨组织工程的关键。本文进行了BMP/α-TCP骨水泥、rhBMP-2/β-TCP陶瓷、兔骨髓基质细胞/β-TCP陶瓷、β-TCP/PLLA与大鼠骨髓基质干细胞复合及β-TCP/PLLA与大鼠骨膜成骨细胞复合几个体系骨组织工程复合材料的研究。本研究首先开发了制备高性能的β-磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）、α-TCP超细陶瓷粉及高性能多孔β-TCP陶瓷新工艺。将自制高纯、超细CaCO₃用去离子水调和成浆料加入到分析纯磷酸配制成的一定浓度的磷酸溶液中反应，配料按Ca/P原子比为1.50。反应在搅拌和超声波震荡下进行，并在十分钟内完成，制得组成为Ca₃（PO₄）₂nH₂O的TCP前驱体沉淀，该沉淀粒度细（0.8-几μm）而均匀，过滤性能优良，固液能快速分离。在1170℃下煅烧TCP前驱体制备β-TCP超细陶瓷粉料，在1230℃下煅烧TCP前驱体制备α-TCP超细陶瓷粉料。TCP前驱体沉淀用3％PVA溶液作粘结剂，20-30目的柱状硬脂酸作成孔剂，经压模成型、干燥、在1170℃下煅烧制得高性能多孔β-TCP生物陶瓷。研究表明，CaCO₃粒度对TCP前驱体粒度、陶瓷的孔隙率、抗压强度以及溶解速度均有影响，根据临床应用需要可以通过选用不同CaCO₃粒度及致孔剂形状大小来调节陶瓷的孔隙率、孔结构，以控制陶瓷强度和溶解速度。该新工艺制备的高纯微细α-TCP粉体具有优良的凝结性能和水化性能。自制高纯微细磷酸氢钙（DCP）、Cao（ds。分别为1.72和1.2 pm）为辅配料，摩尔比为:a一TCP:DCP:CaO=0.95:0.025:0.025，用0.25M NaHZP04/NaZHP04混合液调和，其初凝时间为7分钟，终凝时间为35分钟，在Hank’s溶液里浸泡5天其抗压强度可达到35MPa，达到了颅骨修补材料的强度要求。用Uri St法自小牛长管状骨中提取部分纯化的活性BMP，将BMP与a一TCP固相粉体按比例混合均匀后再与液相反应，制成BMP含量不同的BMP/a一TCP磷酸钙骨水泥复合材料。分别采用单纯a一TCP和BMP含量不同的BMP/a一TCP修复成年兔较大颅骨缺损，4周时可见BMP/Q一TCP材料内大量类骨组织生成并见少量钙沉积;8周时新骨量增加，钙化更多、强度明显增加;16周骨组织进一步成熟，骨缺损由新骨桥连修复。而a一TCP组8、16周时骨生成量和强度均低于BMP/Q一TCP，骨缺损区未形成新骨桥连，但软组织量却明显多于后者。16周时BMP/Q一TCP和Q一TCP的材料吸收量基本相等。本研究将多孔p一TeP和重组人的骨形成蛋白一2（recombinant human bonem6rphogenetie proteins一2，rhBMP一2）复合，制得rh朋P一2/p一TCP复合人工骨材料，将其植入小鼠肌肉内，观察复合物的骨诱导和降解能力。72小时可见幼稚软骨，1周见成熟软骨，2周编织骨和少量板层骨，3周和4周成熟的板层骨生成，对照组则无骨或软骨生成。2周开始间充质细胞和纤维组织长入材料，3⁴周将材料包裹分割，同时可见多核巨细胞反应及吞噬现象，这些是降解早期组织学改变。兔骨髓基质细胞（MSC）在本研究制备的多孔p一TCP表面贴壁生长状态良好，并合成大量胶原纤维，胶原的合成量也较多，表明本研究制备的D一TCP载体具有良好的生物组织相容性，可将p一TCP载体复合MsC制得BMP/p一TCP复合材料，应用于骨组织工程。本论文采用溶液浇铸一模压成型一沥滤三步法研制成具有一定孔隙率、孔径的B一TCP/PLLA多孔复合材料，详细地研究了材料的组成和孔隙率等因素对该复合材料力学性能的影响。结果表明:B一TCP/PL以多孔复合材料的压缩强度和模量随孔隙率的增加而大幅度的降低。低孔隙率（小于70%）时，可以通过改变材料的成分比例和p一TCP的粒径来改善材料的力学性能。而高孔隙率时，材料的力学性能较差，且基本不受成分比例和p一TCP的粒径影响。体外和体内实验表明，经成骨诱导的骨髓基质细胞和骨膜成骨细胞在B一TCP/PLLA多孔复合材 II料能够粘附、增殖、分化，表现出正常的生化功能。B一TCP/PLLA多孔复合材料具有成骨传导性，是骨组织工程支架材料的较好选择。而相对与成骨细胞来说，经成骨诱导的骨髓基质细胞是种子细胞的较好选择。因此可以认为:以B一TCP/PLLA多孔复合材料为细胞支架、经成骨诱导的细胞为种子细胞的复合材料是新型的骨组织工程骨缺损修复材料。

全文目录

1 前言  14-45
  1.1 骨的化学成分与作用  14-16
    1.1.1 骨的作用及骨缺损  14
    1.1.2 骨的有机质  14-15
    1.1.3 骨的无机质  15-16
  1.2 临床上对骨替代材料的要求  16-30
    1.2.1 治疗大块骨缺损传统的方法  16-17
    1.2.2 骨组织工程技术为治疗大块骨缺损提供一条崭新途径  17-23
    1.2.3 用于骨组织工程的诱导因子和生长因子  23-25
    1.2.4 骨组织工程的工程细胞  25-30
  1.3 本章结论  30-31
  1.4 本研究工作的设想  31-33
  参考文献  33-45
2 磷酸钙系原料制备及性能研究  45-66
  2.1 热力学分析  47-51
    2.1.1 磷酸钙化合物在水溶液中的离解  47-50
    2.1.2 磷酸与碳酸钙反应的可能性和限度  50-51
  2.2 磷酸三钙前驱体制备的实验研究  51-54
    2.2.1 原料、分析及检测方法  51
    2.2.2 TCP前驱体制备  51-52
    2.2.3 制备实验结果  52-54
  2.3 高温煅烧制备α-TCP、β-TCP陶瓷粉末研究  54-58
    2.3.1 实验  54-57
    2.3.2 实验结  57-58
  2.4 多孔β-TCP陶瓷的制备  58-62
    2.4.1 实验  58-59
    2.4.2 实验结果  59-62
  2.5 本章结论  62-64
  参考文献  64-66
3 BMP/α-磷酸钙骨水泥生物复合材料制备、性能及兔颅骨缺损修复实验研究  66-134
  3.1 磷酸钙骨水泥概述  66-72
    3.1.1 磷酸钙骨水泥的化学组成  66-67
    3.1.2 磷酸钙骨水泥的理化特点  67-69
    3.1.3 磷酸钙骨水泥在体内的降解、结晶过程  69-70
    3.1.4 磷酸钙骨水泥作为载体的研究  70-71
    3.1.5 CPBCs作为骨缺损修复材料存在的问题  71-72
  3.2 α-TCP骨水泥水化性能研究  72-79
    3.2.1 实验  72-77
    3.2.3 结果讨论  77-79
    3.2.4 本节小结  79
  3.3 牛BMP提取、纯化、活性鉴定及BMP/α-TCP骨水泥制备  79-92
    3.3.1 BMP的纯化提取  80-82
    3.3.2 BMP/α-TCP骨水泥复合材料制备  82-83
    3.3.3 BMP诱导成骨活性测定  83-84
    3.3.4 讨论  84-91
    3.3.5 小结  91-92
  3.4 BMP/α-TCP骨水泥BMP释放动力学、性能研究  92-98
    3.4.1 实验  92-93
    3.4.2 实验结果  93-95
    3.4.3 讨论  95-98
    3.4.4 本节小结  98
  3.5 BMP/α-TCP骨水泥复合材料修补颅骨缺损的动物模型实验研究  98-122
    3.5.1 实验  99-100
    3.5.2 结果  100-116
    3.5.3 讨论  116-121
    3.5.4 BMP/α-TCP作为颅骨修复材料的应用前景及存在问题  121
    3.5.5 小结  121-122
  3.6 本章结论  122-124
  参考文献  124-134
4 多孔rhBMP-2/β-TCP人工骨的诱导成骨和降解行为-小鼠体内的研究  134-143
  4.1 材料和方法  134
  4.2 结果  134-135
    4.2.1 组织形态学观察  134-135
    4.2.2 扫描电镜观察  135
  4.3 讨论  135-141
  4.4 本章结论  141-142
  参考文献  142-143
5 培养状态下兔骨髓基质细胞在可降解多孔β-TCP载体上的细胞学行为  143-147
  5.1 材料与方法  143-144
    5.1.1 材料来源及仪器  143
    5.1.2 兔骨髓基质细胞培养  143
    5.1.3 MSC与多孔β-TCP载体复合  143-144
    5.1.4 SEM标本制作  144
  5.2 结果  144
    5.2.1 未复合细胞多孔β-TCP载体表面SEM观察  144
    5.2.2 培养状态下MSC在β-TCP载体表面的生长情况SEM观察  144
  5.3 讨论  144-145
  5.4 本章结论  145-146
  参考文献  146-147
6 β-磷酸三钙(β-TCP)/聚L-乳酸(PLLA)与大鼠骨髓基质干细胞及β-TCP/PLLA与大鼠骨膜成骨细胞复合的人工骨修复材料的研究  147-182
  6.1 β-TCP/PLLA多孔复合材料的制备及其性能研究  147-157
    6.1.1 实验  148-150
    6.1.2 结果  150-155
    6.1.3 讨论  155-157
    6.1.4 本节小结  157
  6.2 β-TCP/PLLA与大鼠骨髓基质干细胞及β-TCP/PLLA与大鼠骨膜成骨细胞复合的研究  157-168
    6.2.1 材料与方法  158-160
    6.2.2 结果  160-166
    6.2.3 讨论  166-168
    6.2.4 本节小结  168
  6.3 组织工程复合材料异位成骨的实验研究  168-176
    6.3.1 材料与方法  169-170
    6.3.2 结果  170-171
    6.3.3 讨论  171
    6.3.4 本节小结  171-176
  6.4 本章结论  176-178
  参考文献  178-182
7 全文总结  182-185
8 论文创新点  185-191
9 致谢  191

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