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NIH3T3细胞中PKC通过MPF影响G2/M期进程

作　者: 刘莹
导　师: 于秉治
学　校: 中国医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 蛋白激酶C Ca2+ G2／M期阻滞 cyclin B p34cdc2 cdc25C 细胞周期
分类号: Q25
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

前言蛋白激酶C（PKC）是一组丝／苏氨酸蛋白激酶，参与多种信号传导系统。包括细胞分化、生长调控、肿瘤发生和细胞凋亡。PKC家族可分为三组：cPKC，又称传统PKC，包括α、β、γ等，是一组Ca²⁺依赖，二脂酰甘油激活的同工酶；nPKC，也叫新PKC，包括δ、ε、η及θ，是非依赖Ca²⁺、但二脂酰甘油依赖的一组同工酶；aPKC，即非典型PKC，包括ζ和λ两种亚型，体外实验证明是即不依赖Ca²⁺，也非二脂酰甘油激活。PKC的多种亚型在不同细胞中的定位、表达和功能的不同使得PKC可以参与多种信号传递，其参与生长调控的分子机制，也因细胞本身可以合成几种PKC同工酶而变得复杂起来。真核细胞的分裂是一系列受调节过程，这一过程可被一组高度保守的蛋白激酶家族-cyclin依赖激酶（cdks）所调节。Cdks的活化需要结合一种特异的调节亚基-cyclin。cyclin／cdk复合物作为广泛的影响细胞分裂调节物而发挥作用。每一种复合物参与不同的细胞周期各时段的调控。现在，已有大量的不同种类的cyclin／cdk复合物被认识并纯化出来。 G2／M的过渡可受到cdks的调控。在这一过程中一个关键、重要的物质就是MPF（M-phase promoting factor, MPF），即M-期促进因子，又称成熟促进因子（maturation-promoting factor，MPF）。它最先由Masui和Markert在1971年发现，并于1988年从Xenopus laevis卵中纯化。MPF是调节细胞进、出M期所必需的蛋白激酶，具有广泛的生物功能，通过促进靶蛋白的磷酸化而改变其生理活性。MPF自身的活性随着细胞周期的运转而发生周期性变化。MPF是一包含催化亚基p34^cdc2和调节亚基cyclin B的二聚体，p34^cdc2的活性严格依赖cyclin B。在Xenopus卵中，缺乏cyclin B的合成MPF将不能活化。Cyclin B随着细胞周期进程而周期性改变。G1期开始合成，并逐渐增多，在G2期末达到最高量。而在只有cyclin B的量达到一定程度时，p34^cdc2-cyclin B复合物才能从前-MPF（非活化状态）而活化，从而促进细胞周期从G2进入到M期，引起细胞分裂。p34^cdc2有三个重要调节位点Thr14、Tyr15和Thr161分别被其他各种因素调节，当Thr161处于磷酸化，而Thrl4、Tyrls处于脱磷酸化时，p34抛才能被激活。那么，所有能使这些位点的磷酸化水平改变的因素都可能调节 p34“拟的活性，进而调节细胞周期进程。CdC25作为一种磷酸酶在其中可能发挥了作用。在血管内皮细胞，Cdc25磷酸酶表达下降引起 p34”M的 Tyr残基脱磷酸化的抑制而使P34测活性下降。Cyclin B作为调节亚基在整个 MPF的调节过程中也受到多种因素的影响，Cyclin B的表达含量的改变也同样影响着细胞周期。另外，细胞内 ca人在细胞周期进程中也是一重要调节因素。主要的调节方式是通过对P34““的活性调节起作用的。有研究表明，Ca卜和地”螫合剂分别在可通透性细胞和无细胞系统中激活和灭活 p34抛。而 Ca卜在细胞内暂时性升高对 cyhin B的合成并无影响。Ca卜活化 P34”拟的机制第一步是结合cycin B，并且处于磷酸化状态，即 Thr14、Tyrls和 Tlirl61都处于磷酸化状态；第二步是 CdC25磷酸酶通过是 Thr14、Tyr15脱磷酸化而激活 p34”拟。而 Ca从浓度升高降低 p34”怕是通过使 Thr161脱磷酸化及CylcinB 7K解，同时使 P34”帕一cyclin B复合物分解。为了避免 PKC的激动剂OAG（l，Oleoyl－2＊。Cetyl＊Sfl－gy。efol）的加人而影响到细胞内C。‘”浓度，我们在选择OAG的浓度时，则应注意OAG的加人不要影响到细胞内Ca＊浓度的改变。我们的研究主要集中在PKC如何调控MPF，进而调节细胞周期进程的。实验中，应用了PKC的激活剂 OAG和特异性PKC抑制剂CalPhOStin C作用于NIH3Th细胞，来检测在GZ／M期进程中 P34”“和cyclinB转录水平和蛋白表达水平及其活性改变，以及作用后对细胞周期进程，特别是对GZ／M期过渡的影响。方法＊细胞培养与细胞周期同步化小鼠NIH3Th细胞系（中国医科大学细胞生物学教研室提供人用DMEM（d讪ecco’s mo腼ed E8ge’S meditun）培养基加 10％（VOI／VOL）的56℃灭活的胎牛血清，滤膜除菌。细胞周期同步化在m期末用phidicolin（DMSO溶成浓度为 Zllg／ul人在培养瓶中指数生长期的细胞稀释至 2．5 XJO～rnl加人 aPhidicolin，终浓度为 lug／ml培养液，37T CO。培养箱中培养24小时后，用灭菌的PBS洗2次，后加人新鲜培养液。此时细胞停止在 ·二·GI＊期。细胞用胰蛋白酶N．2％）消化后，在 PBS中洗2次，1200 x g离心 10分钟去上清，加人 70％（VOI／VOL）的冷乙醇，于一20t 30分钟。去除乙醇后，细胞中加人含有 RNase AN．lin牙IIl）的 PBS中放在 37 t培养箱 30分钟。然后，细胞被含有50u才IIl ProPidium iodide（si）PBS中染色30分钟，用（BECTON DICKINSON FACScan）型流式细胞仪腻 DNA含量。· 2．RNA提取及 RT—PCR NIH3D细胞（IX 10‘／瓶），DEPC处理的四S洗2次，力人 ’vim＊＊l试剂

全文目录

一、中文摘要  4-10
二、英文摘要  10-16
三、英文缩略语  16-18
四、论文主体  18-58
  第一部分 PKC通过对MPF活性的影响在G2／M期调节细胞周期进程  18-31
    1 前言  18-20
    2 实验材料  20-21
    3 实验方法  21-22
    4 实验结果  22-23
    5 讨论  23-25
    6 结论  25-26
    7 论文图片  26-29
    8 参考文献  29-31
  第二部分 PKC的激动剂OAG对P34~(cdc2)和Cyclin B在转录和翻译水平的影响  31-48
    1 前言  32-33
    2 实验材料  33-35
    3 实验方法  35-37
    4 实验结果  37-38
    5 讨论  38-39
    6 结论  39-41
    7 论文图片  41-45
    8 参考文献  45-48
  第三部分 PKC在Ca~(2+)信号对MPF的调节过程中的作用  48-58
    1 前言  49
    2 实验材料  49-50
    3 实验方法  50-51
    4 实验结果  51
    5 讨论  51-52
    6 结论  52-53
    7 论文图片  53-57
    8 参考文献  57-58
五、致谢  58-59
六、综述  59-74
七、个人简介  74-75
八、在学期间发表论文、获奖等题目  75

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