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乳酸菌高密度培养及浓缩型发酵剂研究

作　者: 刘振民
导　师: 骆承庠
学　校: 东北农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 乳酸菌高密度培养生物化学反应器微滤膜浓缩质粒冷冻损伤浓缩型发酵剂非发酵嗜酸性乳
分类号: TS201
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

乳酸菌下游生物工程技术研究具有重要的理论意义和广阔前景。本文以28株嗜热性乳酸菌和8株嗜温性乳球菌为研究对象，对乳酸菌生物学特性、高密度培养及浓缩型发酵剂制备工艺及有关理论、新产品开发等进行了系统研究，结果如下：嗜热性乳酸菌、嗜温性乳球菌乳糖转运、代谢体系及有关酶类的差别是影响乳酸菌在牛乳中增殖速度的主要因素。两类乳酸菌最大产酸量、产酸率差异明显。蛋白质分解活力影响乳酸菌的增殖速度。筛选的LA32菌株具有良好的益生特性。德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜酸乳杆菌存在23kb的质粒：28kb的质粒也存在于乳酸乳球菌乳酸亚种中。乳酸菌内源性质粒研究对食品级载体的构建和优良菌株的分子育种具有重要意义。以乳酸菌生物学特性和单因子试验为基础，设计出乳酸菌高密度增殖培养基——新型pH值内控型乳清基质培养基，营养均衡，缓冲能力强，乳酸菌比生长速率较大，优于MRS培养基和牛乳培养基，为0.9218h^-1，德氏乳杆菌保加利亚亚种的最短代时为38.79min。选用Logistic equation作为菌体细胞生长的动力学模型，研究得出：德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体分批培养的动力学方程为： Cx（t）=0.2503·e⁰（0.3847t）／{1-（0.2503／3.628）(1-e^0.3847t) 乳酸乳球菌乳酸亚种菌体分批培养的动力学方程为： Cx（t）=0.2472·e^0.2092t／{1-（0.2472／2.128）(1-e^0.2092t) 为进一步放大试验和工业化生产以及优化培养工艺提供了理论模型。培养温度为42℃时，唾液链球菌嗜热亚种、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种的比生长速率分别为0.5649、0.5260、0.5931h^-1；培养温度为30℃时，乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种、乳酸乳球菌乳油亚种的比生长速率分别为0.4770、0.2534、0.2765 h^-1；接种量大，菌体的生物量增量大，比生长速率降低；摇瓶培养中溶解氧增大，乳酸菌生物量增量减小，进行乳酸菌培养时，不宜采用搅拌操作。选择培养基起始pH值、培养时间和培养温度三因素进行分批培养条件的优化，所得模型的实际值方程为： y=-77.2404+9.0272x₁+1.0836x₂+2.0864x₃-0.0093x₂²-0.021lx₂x₃-0.0164x₃² 生物量在5.0以上的培养条件为：培养基起始pH值为6.7～6.9、培养时间为18～21h、培养温度为37～39℃。研究了最新发酵技术对乳酸菌高密度培养的影响。与常规培养相比，等pH值培养技术一定程度上克服了因pH值下降、乳酸积累而引起的酸损伤，菌体密度较高。嗜酸乳杆菌在pH5.5进行恒定pH值培养，菌数可达到3.89×10⁹cfu／mL。理论分析表明：在单一补料分批培养的准恒定状态下，稀释率与比生长速率基本相同，即μ≈D。采用全营养物质的连续流加法，在对数生长末期进行补料操作，确定起始培养基流加速率为5．874×10^-4m³/h。德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌体密度可达1.0×10¹⁰cfu/mL。一首次采用先进的微滤技术浓缩乳酸菌液，结果表明：微滤浓缩、超滤浓缩、离心浓缩的浓缩比分别为 19．lJ．9、15．9倍，脚后的菌液浓度分别为 115X10‘、讪L、979 X 100cthe、5．38 X 10’CaL。扫描电镜（SEM）观察表明乳酸菌可以被 0．illm的微滤膜有效截留。微滤技术是制备乳酸菌浓缩液的有效手段。将微滤膜浓缩与反应器相偶联，设计出新型乳酸菌高密度培养的生化反应器。利用微滤膜的隔离作用实现抑制性代谢产物的转移和菌体的浓缩；同时进行pH值控制培养和新鲜培养基的补料操作，达到乳酸菌的高密度培养。理论分析表明在单罐连续培养体系的恒定状态下leq。在对数生长末期进行全营养料流加的补料速率为 6．540X10“m’h‘。与分批培养相比，在膜主物反应器中 LDB的菌体密度可达 l．IX 10’‘cJllflllL，增加为 550倍，比主长速率增加 20．3％，达到 0．8576 h‘。乳酸菌发酵液可直接用于冻藏浓缩发酵剂或冻于直投型发酵剂的生产。进行了高活力菌株的筛选，杆菌对冷冻的耐受性低于球菌；稳定期前期收获的菌体对应激条件的抵抗力强，存活率较高；冷激处理可以提高菌体的存活率，这与抗冻蛋白质或某些抗冻物质的产生有关。－74℃比－20℃更利于菌体的保护。乳酸菌冷冻干燥过中，残余的水分含量在2－3％，菌体的相对存活率较高；在冷冻干燥过程中，存在两个最大冰晶的生成带，即：o3了℃和－3De－37．4C。快速通过冰晶生成带可以减小菌体的冷冻损伤。复合保护剂优于单一保护剂，保护剂之间存在协同效应。LDB菌株在冻干前后质粒保持了很好的稳定性。液态发酵剂、冻干发酵剂、冻藏发酵剂的生长迟滞期分别为〕石1、互二6、口．84h：对数生长末期的产酸率分别为0．5992、03968。05159PH血。冻藏发酵剂比冻干发酵剂更利子保持菌体的活力。透射电镜（TEM）观察表明：乳酸菌经过冻融处理，菌体致死率增加、损伤严重，出现菌体中间断裂、后端溶解等现象。杆菌比球菌易于受损。生化试验表明冻藏、冻干样的菌体细胞膜通透性增加，裂解的菌体内容物释放，核酸、蛋白质等可溶性

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
前言  10-23
  1．乳酸菌概述  10-13
  2．乳酸菌发酵剂的功能  13-18
  3．浓缩型发酵剂研究  18-21
  4．本课题的研究意义和主要内容  21-23
材料与方法  23-34
  1．主要材料与设备  23-25
    1．1 试验用菌株  23
    1．2 原料与试剂  23-24
    1．3 培养基  24
    1．4 仪器与设备  24-25
  2．方法  25-34
    2．1 乳酸菌产酸特性的研究  25
    2．2 乳酸菌蛋白质分解特性的研究  25-26
    2．3 乳酸菌的益生特性研究  26
    2．4 乳酸菌质粒提取研究  26-27
    2．5 乳酸菌培养基研究  27-28
    2．6 乳酸菌的生长动力学研究  28
    2．7 乳酸菌高密度培养条件研究  28-29
    2．8 乳酸菌膜过滤浓缩研究  29-30
    2．9 微滤膜偶联生物化学反应器进行乳酸菌高密度培养的研究  30
    2．10 乳酸菌冻藏研究  30
    2．11 乳酸菌冻干研究  30
    2．12 乳酸菌冷冻损伤研究  30-32
    2．13 乳酸菌的玻璃化冻藏  32
    2．14 抗生素的敏感性试验  32
    2．15 非发酵嗜酸性益生乳的研究  32-33
    2．16 新鲜干酪的研究  33-34
结果分析与讨论  34-104
  1．乳酸菌产酸特性研究  34-37
  2．乳酸菌蛋白质分解特性的研究  37-38
  3．乳酸菌益生特性的研究  38-41
  4．乳酸菌质粒提取的研究  41-44
  5．乳酸菌高密度培养的培养基设计  44-52
  6．乳酸菌分批培养的菌体增殖动力学  52-55
  7．乳酸菌高密度培养条件研究  55-57
  8．乳酸菌分批培养条件的优化  57-63
  9 新型发酵技术用于乳酸菌高密度培养的研究  63-67
  10．乳酸菌膜过滤浓缩研究  67-73
  11．微滤浓缩的扫描电镜（SEN）观察  73-76
  12．微滤膜偶联生化反应器用于乳酸菌高密度培养的研究  76-79
  13．乳酸菌冻藏研究  79-86
  14．乳酸菌冻干研究  86-92
  15．乳酸菌冷冻损伤研究  92-96
  16．乳酸菌的玻璃化冻藏  96-97
  17 发酵剂菌株抑制因子试验  97-98
  18．非发酵嗜酸益生乳的研究  98-101
  19．新鲜干酪研究  101-104
结论  104-107
参考文献  107-115
致谢  115-116

乳酸菌高密度培养及浓缩型发酵剂研究

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