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抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究

作　者: 安广宇
导　师: 阮长耿
学　校: 苏州大学
专　业: 内科血液学
关键词: 血小板 膜糖蛋白Ⅲa 噬菌体展示 单链抗体(ScFv) 嵌合 Fab 原核表达 体外特性
分类号: R392-33
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


血小板血栓形成是血管闭塞性疾病的主要成因。其表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集最终共同途径的关键要素。阻断GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合，能高效地抑制血小板的聚集，进而使血小板血栓不能形成。SZ-21是我室制备的一株针对GPⅢa的单克隆抗体，经家兔颈动—静脉血栓模型证实能显著降低血栓形成，显示了在抗血栓治疗中的潜在价值。为降低鼠源性单抗免疫原性（HAMA）及全抗体Fc段对血小板的破坏，本研究将SZ-21制备成小分子抗体，并对这一抗体片段进行了纯化、复性和体外性质的研究。一 SZ-21单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析 采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从分泌抗血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ-21杂交瘤细胞中克隆了该抗体的重、轻链可变区（V区）基因，并测序分析。SZ-21重链（VH）基因全长为342 bp，轻链（VL）基因全长为306 bp，分别编码114和102个氨基酸。基因序列登录号为VH：AF354053，VL：AF354054。二 SZ-21单链抗体（SZ-21ScFv）基因的筛选和表达 为最大限度地保留单链抗体的血小板结合活性，利用噬菌体展示技术进行了高亲和力筛选。将SZ-21 VH和VL基因分别与含有（Gly4Ser）3多肽接头的载体pSW1-ScFv连接，构建成单链抗体基因pSW1-SZ21ScFv，克隆到噬菌体分泌型表达载体pHEN1中。同时亲和层析纯化血小板膜糖蛋白Ⅲa，用糖蛋白Ⅲa作为抗原进行高亲和力筛选。经过四轮“吸附—洗脱—扩增”的富集过程，phage-ELISA得到一个具有与血小板高亲和力的克隆，转化E.coli HB2151，表达了可溶性ScFv融合蛋白。ELISA和Western blot证实该融合蛋白保留了亲本抗体的血小板结合特性。三 SZ-21单链抗体高效表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达 将上述筛选得到的单链抗体基因亚克隆到大肠杆菌融合型表达载体pET20b中，得到pET20b-21ScFv。通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究 摘 要 BLZI（DE3）PlysS中表达了功能分子。SDS－PAGE和 Western blot显 示表达产物的分子量为27000。该融合蛋白除少量为分泌型表达外， 主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的 21％，约 20 m叭。同 时探索了该抗体片段的最佳复性条件。把包涵体形式表达的 SZ上 单 链抗体片段用尿素溶解，经过蛋白质的体外重折叠复性过程，成功地 得到具有活性的单链抗体片段。ELISA和Western印迹检测证实，该 鱼链抗体保留了与血小板特异结合的能力。 四SZ毛 的纯化和体外性质研究 通过NINTA树脂亲和吸附纯化，获得具有活性的高纯度单链抗 体片段，纯度达95％以上。流式细胞仪检测证实该单链抗体能与人脐 静脉内皮细胞和血小板反应。体外实验表明，SZ2 单链抗体能够抑 制 ADP诱导的血小板聚集，其抑制能力呈剂量依赖性，其 IC刃为 12 ug／mL，在浓度为20 ug／mL时达到最大抑制率。对花生四稀酸诱导的 血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ上 单链抗体同样能够抑 制纤维蛋白原与血小板的结合，显示了其抗血栓作用。 以上结果表明，制备的基因工程抗体具有原鼠单克隆抗体的抗 血栓形成能力，减少了全抗体的人抗鼠抗体反应(HAMAh 同时该小 分子抗体片段去除了抗体的FC段，避免鼠源性单克隆抗体引起血小 板严重下降的副作用。该单链抗体有望用于抗血栓治疗。 五抗血小板膜糟蛋白单抗SZ毛 嵌合Fab片段基因构建和表达研究 利用基因克隆技术，从杂交瘤细胞系 SZ上 中克隆出轻、重链可 变区基因，然后亚克隆到含有人恒区基因C＊和C。的质粒pSWIFab 中，构建成人一鼠嵌合Fab抗体片段质粒pSZ2，在大肠杆菌中表 达了可溶性＊b抗体片段。SDS－PAGE显示在分子量（Mr）45 000处 有一诱导条带，与该嵌合抗体的理论计算值相符。表达量约为 800 fig／L， ELISA和Western检测证实表达产物具有与血小板结合的活性。

全文目录


一 摘 要  3-8
二 引 言  8-10
三 正 文  10-61
  第一部分 抗血小板膜糖蛋白SZ-21单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析  10-18
  第二部分 SZ-21单链抗体（SZ-21ScFv）基因的筛选和表达  18-32
  第三部分 SZ-21单链抗体高效表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达  32-42
  第四部分 SZ-21单链抗体的纯化、复性和体外性质研究  42-53
  第五部分 抗血小板膜糖蛋白单抗SZ-21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究  53-61
四 综 述 血小板膜糖蛋白受体拮抗剂研究进展  61-73
五 结 论  73-75
六 已刊文章及获得基金情况  75-76
七 致 谢  76

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 研究方法 > 免疫学技术、设备及实验方法
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