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我国部分地区鸡源空肠弯曲菌流行病学及运送flaA基因的壳聚糖纳米DNA疫苗免疫生物学特性研究

作 者: 黄金林
导 师: 焦新安
学 校: 扬州大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 空肠弯曲菌  流行病学 毒力基因 RAPD PFGE 壳聚糖 DNA疫苗 免疫生物学特性
分类号: S858.31
类 型: 博士论文
年 份: 2008年
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内容摘要


弯曲菌(Campylobacter)是全球范围内主要的人兽共患性、细菌性肠道病原菌之一,对人致病的弯曲菌中99%的是空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C. jejuni),其次是结肠弯曲菌(Campylobacter coli,C. coli),其它弯曲菌偶尔致病。特定血清型空肠弯曲菌引起的肠炎是人格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)的重要前驱因子。近年来,许多国家人弯曲菌病的发生率呈指数增长趋势。弯曲菌是野生、家养动物的正常寄居菌,在肠道内有大量细菌,感染的动物通常无明显病症,但可长期向外界排菌,通过排泄物或分娩污染食物和饮水,从而引起人类感染。其中,家禽是弯曲菌病最重要的传染源,控制或清除禽类弯曲菌是预防和控制人空肠弯曲菌的重要前提。本研究的主要内容与目的是:(1)较为系统地调查与分析我国部分地区群中弯曲菌流行特点,并应用国标方法鉴定分离株的生化特性,以2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的琼脂扩散法进行耐药分析;(2)鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析及对HT-29细胞感染分析;(3)基于RAPDPFGE技术的不同源空肠弯曲菌分离株分子亚分型研究,探究鸡空肠弯曲菌在人弯曲菌病中的作用;(4)鸡空肠弯曲菌新型DNA疫苗构建及其免疫生物学特性。1我国部分地区鸡群中弯曲菌流行现状和耐药特性调查与分析2005年7月至2007年12月,选取我国部分省市,采集不同品种、不同类型的鸡群样品进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行病学调查,40个鸡群中空肠弯曲菌阳性的有34个,阳性率为85%、结肠弯曲菌阳性率40%。在4 891份鸡肛门棉拭样品中,共检测出773份空肠弯曲菌阳性、平均阳性率15.80%,55份结肠弯曲菌阳性、平均阳性率1.12%;其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌混合污染的样品为19份,平均阳性率0.39%以上;鸡饲养环境样品217份,6份空肠弯曲菌阳性,阳性率2.76%。不同鸡群感染率悬殊较大,空肠弯曲菌阳性率从0到73.3%、结肠弯曲菌从0到7.4%。流行病学统计分析表明,规模化饲养鸡群的感染率显著高于散养鸡群(p<0.01),品系鸡群显著高于非品系(p<0.01),不同品系鸡群的感染率存在较大差异,我国地方品种鸡的鸡群感染率较低,祖代鸡群的感染率显著高于商品代和父母代(p<0.01)。240株鸡源空肠弯曲菌、34株结肠弯曲菌的生化特性和耐药性研究显示,空肠弯曲菌对8大类21种抗生素高度敏感的是:阿莫西林(AMC)96.67%、庆大霉素(CN)90.00%、阿齐红霉素(AZM)91.25%、链霉素(S)87.92%、红霉素(E)85.42%,高度耐药的是:头孢拉定(CE)98.33%、头孢哌酮(CFP)100.00%、头孢克罗(CEC)92.50%、诺氟沙星(NOR)92.08%、恩诺沙星(ENR)95.68%、环丙沙星(CIP)92.08%、左悬氧氟沙星(LEV)91.25%、复方新诺明(SXT)99.58%、四环素(TE)89.58%、强力霉素(DO)88.33%;耐药谱主要集中在8耐至14耐,达90.00%。34株结肠弯曲菌只对阿莫西林(AMC)高度敏感,91.18%。结肠弯曲菌耐药性和多重耐药性较空肠弯曲菌更为严重。不同地区、不同种类鸡群分离株耐药性和多重耐药性存在差异。我国鸡群的空肠弯曲菌对临床上常用的喹诺酮类、磺胺类、四环素类和大多数头孢菌素类抗生素均产生了不同程度的耐药性;而且结肠弯曲菌的耐药性更为严重,值得关注,必须加强各地弯曲菌耐药性和抗生素使用情况的监测,及时调整用药方案和公共卫生策略。2鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析及对HT-29细胞感染分析282株鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析显示,黏附相关基因cadF、peb1A、racR的平均携带率分别为90.07%、95.04%和97.87%,趋化性调节基因cheY、docA的平均携带率分别为95.39%和92.20%,侵袭蛋白基因iamA的平均携带率为87.94%,鞭毛蛋白基因flaA的平均携带率为86.17%,毒素调节基因cdt、wlaN和virB11质粒基因的平均携带率分别为71.28%、48.94%和7.08%;86.75%的细菌含有6个以上的毒力相关基因。结果显示,不同来源鸡分离株的毒力相关基因携带无显著性差异。分离株对HT-29细胞的侵袭力试验表明,119株分离株中,65株细菌无侵袭能力,占总数的54.62%;44株细菌的侵袭能力比较低,在0.0001%-0.1%之间,菌株所占比例为36.97%;10株细菌的侵袭能力较高,在0.1%-2%之间,比例为8.40%。不同侵袭能力分离株毒力相关基因分析显示:随着侵袭力的不同,分离株的基因携带有一定变化,flaA、cadF、docA、racR、iamA、peb1A和cheY的携带率随侵袭力上升而下降,而wlaN和cdt随侵袭力上升而上升。侵袭力与相关基因有密切关系,但非一一对应关系,而是相互作用,互为交叉的关系。不同谱系分离株对HT-29的黏附率和侵袭率表明,谱系Ⅳ分离株高于谱系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分离株,相关毒力基因分析显示,在空肠弯曲菌侵袭HT-29上皮细胞过程中,黏附相关基因cadF、peb1A、racR,趋化性调节基因cheY、docA和侵袭蛋白基因iamA起重要作用。3不同源空肠弯曲菌分离株RAPD和PFGE分子亚分型研究337株不同来源的空肠弯曲菌PCR-RAPD分析表明,共得到27个基因型别,主要型别有5、6、7、9、12、14、15、22,占83.09%,其中菌株分布最集中的是型别5、9、14和15,所占比例分别为14.84%、17.51%、11.28%和12.76%,而在型别1-4、8、10、13、17、20、21和24-27中出现的菌株较少,比例均低于1%。此外,在不同来源分离的菌株中均含有5、7、9、14和15基因型别,占63.51%。276株不同源分离株PFGE图谱可分为4个遗传谱系、46个克隆组群,且我国空肠弯曲菌分离株主要属于PFGE遗传谱系Ⅲ和Ⅳ。不同源分离株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ遗传谱系中,不同源分离株在各克隆组群中呈交叉分布,鸡源分离株均占有优势,分别为50%、65%、70.59%、64.10%,而腹泻病人、牛群和市场食品分离株遗传谱型分布于各型中,表明鸡是空肠弯曲菌感染的主要来源。分子亚分型研究分析表明,PCR-RAPD和PFGE可作为研究空肠弯曲菌来源和传播途径的有力工具,且PFGE的分辨力强于PCR-RAPD。我国空肠弯曲菌分离株存在优势的遗传谱系,不同源分离株呈高度交叉分布,人弯曲菌的感染与市场食品、动物源弯曲菌感染密切相关,可能存在着相同的传染源,而且鸡源弯曲菌是人类弯曲菌病的主要传染源之一。4运送空肠弯曲菌flaA基因的壳聚糖纳米DNA疫苗免疫生物学特性根据GenBank登陆序列(gi:30407139),利用DNAStar软件分析,按正确的阅读顺序设计合成引物,PCR扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA,将PCR产物回收、序列测定后,与pGEM○R T easy vector连接构建重组质粒pT-flaA,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切回收后插入经同样双酶切的pCAGGS载体,构建成pCAGGS-flaA。将重组质粒pCAGGS-flaA转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测表明重组质粒pCAGGS-flaA在转染的COS-7细胞中能检测到表达蛋白。应用现代纳米技术研制壳聚糖-重组质粒,1%琼脂糖电泳检测表明壳聚糖已经包裹了质粒,包裹率达91.9%,透射电子显微镜观察到壳聚糖已将质粒包裹形成直径100 nm左右的圆球形颗粒。白莱航鸡动物试验显示,二免后14天均能检测到特异性抗体,但抗体滴度较低;三免后14天抗体水平上升明显,能诱导鸡产生针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白的体液、黏膜免疫应答,且与对照组具有显著性差异(p<0.01);流式细胞仪测定鸡脾脏和盲肠扁桃体CD4+/CD8+细胞的数量变化表明,CS-pCAGGS-flaA三免后导致脾脏和盲肠扁桃体CD4+/CD8+细胞数量比值的升高,CD4+细胞的数量高于CD8+细胞。RT-PCR测定鸡脾脏细胞IL-4、IFN-γ可知,二免、三免后14天脾脏细胞IL-4的量强于对照组,且IL-4的量强于IFN-γ。口服攻毒后,疫苗组在测定的时间内泄殖腔排毒率呈现下降趋势,21d后的排毒率为0,而对照组的排毒率保持相对稳定、高排毒水平;空肠弯曲菌在疫苗组小肠、大肠、盲肠和血液中的细菌量大致呈抛物线状,大约在9d-15d间达到高峰,然后呈下降趋势;而对照组在各脏器的分布呈上升趋势。免疫组小肠、大肠、盲肠和血液中细菌的细菌数量均低于对照组, 18d后能有效清除小肠内空肠弯曲菌,免疫组大肠、盲肠和血液的细菌数量较对照组分别降低2lg-3 lg、2lg和2lg-3lg数量。

全文目录


中文摘要  3-7
英文摘要  7-12
目录  12-15
符号说明  15-17
第一章 我国部分地区群中弯曲菌流行病学和药敏特性调查与分析  17-47
  1 材料与方法  19-24
    1.1 材料  19-21
    1.2 方法  21-24
  2 结果  24-42
    2.1 鸡群中弯曲菌的流行病学分析  24-30
    2.2 细菌分离  30
    2.3 生化特性鉴定  30-31
    2.4 鸡空肠弯曲菌的药敏特性分析  31-40
    2.5 鸡结肠弯曲菌的药敏特性分析  40-42
  3 讨论  42-45
  4 参考文献  45-47
第二章 鸡源空肠弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析及对HT-29 细胞感染分析  47-62
  1 材料和方法  48-52
    1.1 材料  48-49
    1.2 方法  49-52
  2 结果  52-56
    2.1 菌株鉴定  52
    2.2 毒力相关基因PCR 扩增结果  52
    2.3 鸡源空肠弯曲菌毒力相关基因分析  52-54
    2.4 鸡源空肠弯曲菌对HT-29 细胞作用及毒力相关基因分析  54-56
  3 讨论  56-59
  4 参考文献  59-62
第三章 不同源空肠弯曲菌分离株RAPDPFGE 分子亚分型研究  62-87
  1 材料与方法  63-66
    1.1 菌株来源及鉴定  63-64
    1.2 RAPD  64-65
    1.3 PFGE  65-66
  2 结果  66-82
    2.1 菌株鉴定  66-67
    2.2 RAPD  67-71
    2.3 不同源分离株PFGE分析  71-76
    2.4 鸡分离株PFGE分析  76-80
    2.5 腹泻病人分离株PFGE 分析  80
    2.6 牛分离株PFGE分析  80-82
  3 讨论  82-85
  4 参考文献  85-87
第四章 运送空肠弯曲菌flaA 基因的壳聚糖纳米DNA 疫苗免疫生物学特性  87-107
  1 材料与方法  88-96
    1.1 材料  88-89
    1.2 重组质粒pCAGGS-flaA 构建  89-92
    1.3 重组质粒pCAGGS-flaA 的大量提取  92
    1.4 重组质粒pCAGGS-flaA 转染COS-7 细胞  92
    1.5 壳聚糖-质粒纳米颗粒的制备与鉴定  92-93
    1.6 动物试验  93-96
    1.7 统计学分析  96
  2 结果  96-102
    2.1 空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA PCR 扩增  96
    2.2 重组质粒pT-flaA 酶切鉴定  96-97
    2.3 重组质粒pCAGGS-flaA 酶切鉴定  97
    2.4 重组质粒pCAGGS-flaA 转染COS-7 细胞结果  97
    2.5 壳聚糖-质粒纳米颗粒的鉴定  97-99
    2.6 鸡的免疫原性试验结果  99-102
  3 讨论  102-104
  4 参考文献  104-107
综述 鸡弯曲菌研究进展  107-155
  1 弯曲菌病与禽  109-112
    1.1 人弯曲菌病  109-110
    1.2 弯曲菌和动物疾病  110-111
    1.3 人弯曲菌病的来源  111-112
  2 鸡弯曲菌感染源  112-122
    2.1 鸡空肠弯曲菌的生理学与生态学  113-114
    2.2 鸡弯曲菌的流行现况  114-116
    2.3 禽弯曲菌感染途径  116-122
  3 家禽弯曲菌生态小生境的组成  122-127
    3.1 弯曲菌的生理学  122-124
    3.2 弯曲菌的应激应答  124-127
  4 鸡弯曲菌疫苗  127-135
    4.1 人弯曲菌  127-128
    4.2 鸡弯曲菌  128-129
    4.3 鸡弯曲菌疫苗的研究进展  129-132
    4.4 新型疫苗策略  132-134
    4.5 展望  134-135
  5 参考文献  135-155
结论  155-156
致谢  156-157
攻读学位论文期间发表的学术论文与科研成果  157-158

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 >
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