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T淋巴细胞介导的免疫反应在腹主动脉瘤发病机制中的作用

作　者: 许文平
导　师: 李志樑
学　校: 南方医科大学
专　业: 心血管内科
关键词: T淋巴细胞 Th1/Th2细胞因子腹主动脉瘤炎症免疫金属基质质酶9 动物模型
分类号: R543
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysms AAA)是以腹主动脉进行性扩张为主要特点的一类严重的血管疾病。该病具有发病的隐蔽性大、终末致死率高的特点。随着人口老龄化及影像诊断技术的飞速发展,AAA的发病率呈逐年增加的趋势。如何有效防治腹主动脉瘤的形成及扩张一直是大家关注的焦点。但其早期的发病机制至今仍不十分明了,这种现状严重阻碍了腹主动脉瘤的防治效果。动脉粥样硬化、高血压、吸烟等被认为是腹主动脉瘤发病的高危因素,远离或者控制这些高危因素,在一定程度上预防了AAA发展。随着遗传学、分子生物学、免疫等现代科学的高速发展,人们对腹主动脉瘤发病机制有了更为深入的认识。目前认为：腹主动脉瘤是环境、遗传、生物化学等多因素共同作用的结果。在感染、动脉硬化、高血压、吸烟等病因的影响下,动脉血管壁受损,机体免疫反应被激活,引起血管壁炎症细胞浸润、血管平滑肌细胞凋亡、细胞外基质代谢失衡,动脉中层弹力纤维断裂,最终导致动脉瘤的形成、加速扩张乃至破裂。因而AAA最有可能代表的是免疫介导的炎症反应这一观点已被大家一致认可。既然腹主动脉瘤发病机制的关键是动脉局部的慢性炎症及免疫反应,在腹主动脉瘤形成过程中炎症细胞浸润的种类及其介导的免疫反应机制就成为人们研究的重点。首先,研究显示动脉壁有引发免疫反应发生的微环境,正常动脉内膜存在一种血管相关淋巴组织(Vcular-scoiated lymphoid tissue VALT),类似于呼吸道和胃肠道中的粘膜相关淋巴组织,散在分布着一些由免疫活性细胞和抗原呈递细胞组成的细胞群,对血管组织中可能有害的内源性或外源性抗原进行监视和筛查。在腹主动脉瘤外膜存在大量VALT,这为动脉局部的免疫反应提供了适宜的场所。同时人们对腹主动脉瘤形成过程中炎症细胞浸润的种类已基本明了。研究表明：在动脉瘤局部存在大量炎症细胞浸润,其中以T淋巴细胞、巨噬细胞(macrophages)的浸润最为显著。进一步的研究表明,在腹主动脉瘤患者外周血中存在大量活化的T淋巴细胞增殖产生的炎症细胞因子。诸多的研究结果让人们对T淋巴细胞在腹主动脉瘤发病机制中的作用产生了浓厚兴趣。随着研究的进展,越来越多的证据表明腹主动脉瘤的形成及扩张是多因素综合作用下,不同的T淋巴细胞亚群及其与巨噬细胞等相互作用下的适应性细胞免疫反应的过程。但其确切的免疫反应机制尚不十分清楚。深入研究腹主动脉瘤发生发展过程中T淋巴细胞介导的免疫反应机制,对进一步明确腹主动脉瘤的发病机理并进行针对性干预有着十分重要的意义。外周成熟的T淋巴细胞按CD分子不同分成CD4+和CD8+两大亚群；按功能不同,可分为辅助性T细胞(help T cell, Th)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,Tc)和抑制性T细胞(suppressor T cell, Ts)。在CD4+Th细胞根据所分泌的细胞因子不同,又可分为Th0、Th1、Th2、Th3等亚组。抗原刺激后,原始T细胞即Th0细胞,可产生多种细胞因子。随后受细胞因子、抗原特性和其他激素等因素的影响,Th0细胞逐渐向Th1和Th2分化。Th1细胞偏向分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等,与Tc细胞和TDTH的增殖、分化和成熟有关,主要促进细胞介导的免疫应答；Th2细胞偏向于分泌IL-4、IL-10等,与B细胞增殖、成熟和促进抗体的生成有关,故可增强抗体介导的体液免疫。正常情况下,Th1/Th2细胞存在着网络调节,细胞功能趋于动态平衡。病理条件下,Th1/Th2细胞亚组可能出现功能失衡,促进机体免疫及炎症反应的发生。在腹主动脉瘤形成过程中,腹主动脉瘤患者体内炎症状态如何?在腹主动脉瘤发生发展过程中,是否存在T淋巴细胞亚组的功能失衡?在早期腹主动脉瘤的形成过程中,T淋巴细胞是否介导了免疫及炎症反应?其作用机理如何?本实验从检测不同发展时期腹主动脉瘤患者外周血T淋巴细胞亚群及亚组为出发点,初步探讨T淋巴细胞所介导的免疫反应在腹主动脉瘤形成及扩张中的作用,为腹主动脉瘤免疫发病机制的阐明奠定一定的实验基础。本实验分为三部分。首先,我们分别入选临床上正常对照组、小腹主动脉瘤患者组(腹主动脉直径<5.5 cm)、大腹主动脉瘤患者组(腹主动脉直径>5.5cm),共30例患者。通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent say, ELISA),检测各组人群外周血及T淋巴细胞培养上清中Th1/Th2细胞因子水平,了解不同时期腹主动脉瘤患者体内的炎症激活状况及Th1/Th2细胞亚组之间的平衡情况；通过流式细胞检测技术检测外周血CD4+CD28-T和CD8+CD28-T细胞亚群分布,初步探讨T淋巴细胞亚群的变化在腹主动脉瘤不同发展时期中的作用。为更进一步了解T淋巴细胞在早期腹主动脉瘤形成过程中的作用,我们建立了以大鼠肾下腹主动脉加压灌注弹力蛋白酶的AAA动物模型。于术后3天、7天、14天获取各组大鼠的外周血、腹主动脉的标本,动态观察各组大鼠的不同组织器官中T淋巴细胞浸润情况及亚群比例变化,分析其变化对腹主动脉瘤发生发展的影响。最后,我们重点观察在大鼠腹主动脉瘤形成过程中,动脉局部Th1细胞因子(IFN-γ)与Th2细胞因子(IL-4)基因表达差别,及其与动脉基质金属酶变化的关系,探讨T淋巴细胞介导的炎症及免疫反应与基质金属酶活性变化的关系,以期更深入了解腹主动脉瘤免疫发病机制。通过对T淋巴细胞在早期腹主动脉瘤发生发展中的作用研究,旨在为AAA发生发展的免疫介导学说提供实验依据,为腹主动脉瘤的防治提供新的理论平台。结果分述如下：1.腹主动脉瘤患者外周血T淋巴细胞的活化及亚群的变化1.1各组患者一般临床资料情况比较临床入选病例总共30例,其中小AAA组10例、大AAA组10例、正常对照组10例。一般临床资料的比较显示：各组的年龄相比无显著性差异(P>0.05)。各组中腹主动脉瘤发病的危险因素,如：吸烟(Smoking)、高血压(Hypertension)、性别等相互之间的比较均无显著性差异(P>0.05)。所有研究对象均排除感染、全身免疫性疾病、恶性肿瘤及肝肾功能不全。1.2各组患者血浆Th1/Th2亚组细胞因子水平变化正常对照组、小AAA、大AAA组的血清IFN-γ表达量分别为4.10±0.90,17.25±2.20,21.26±3.35 pg/ml以及血清TNF-α表达量分别为33.3±6.63,55.05±5.20,59.62±7.21pg/ml。IFN-γ和TNF-α分别在三组间差异有显著性意义(FIFN-γ=142.70,P=0.000和FTNF-α=51.76,P=0.000)。正常对照组、小AAA组和大AAA组的血清IL-4表达量分别为5.27±1.72,6.82±1.72,和5.26±1.32pg/ml；血清IL-10表达量分别为32.62±8.69,33.37±9.37和30.67±10.46pg/ml。IL-4和IL-10分别在三组间差异无显著性意义(FIL-4=5.38,P=0.640和FIL-10=0.27,P=0.790)。1.3各组患者外周血分离T淋巴细胞培养上清Th1/Th2细胞因子检测正常对照组、小AAA组、大AAA组的培养上清IFN-γ表达量分别为620.05±146.48,1740.05±291.58,1932.26±145.86pg/ml；培养上清TNF-α表达量分别为510.39±62.41,820.39±151.88,935.14±80.83pg/ml。IFN-γ和TNF-α在三组间差异有显著性意义(FIFN-γ=117.93,P=0.000和FTNF-α=43.24,P=0.000)。正常对照组、小AAA组和大AAA组的培养上清IL-4表达量分别为54.69±9.82,67.69±7.74和60.8±6.66pg/ml；培养上清IL-10表达量分别为28.69±6.22,36.39±7.26和29.46±4.45pg/ml,IL-4和IL-10分别在三组间差异无显著性意义(FIL-4=6.323,P=0.106和FIL-10=4.85,P=0.779)。1.4各组腹主动脉瘤患者腹主动脉直径与Th1和Th2细胞因子浓度的关系正常对照组、小AAA组和大AAA组的腹主动脉直径分别为2.49±0.29,4.13±0.67,6.41±0.77cm,与血浆中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10浓度的相关性分别为(相关系数RIFN-γ=0.847,P=0.000；相关系数RTNF-α=0.695,P=0.000；相关系数RIL-4=-0.071,P=0.709；相关系数RIL-10γ=-0.01,P=0.956),与细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10浓度的相关性分别为(相关系数RIFN-γ=0.718,P=0.000；相关系数RTNF-α=0.765,P=0.000；相关系数RIL-4=0.18,P=0.351；相关系数RIL-10=0.083,P=0.661)。结果表明,随着腹主动脉瘤直径的扩张,外周血中Th1型细胞因子逐渐升高,两者有正相关关系。外周血中Th2细胞因子浓度与动脉瘤直径无明显相关性。1.5各组患者外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞数量及CD4+CD28-和CD8+CD28-T淋巴细胞亚组占CD4+及CD8+T淋巴细胞总数比例情况正常对照组、小AAA组和大AAA组的CD4+T细胞数量分别为1211±654.1,906.3±250.62,717.4±200.76/ul,CD8+T细胞数量为333.1±235.48,301.3±153.13,333.5±140.09/ul。CD4+/CD8+T细胞比例分别为3.01±1.91%,3.65±1.89%,2.70±1.68%。CD4+T、CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+T比例分别在三组间差异无显著性意义(F CD4+=0.693,P=0.509, F CD8+=0.369, F CD4+/CD8+=6.323,均P>0.05)。正常对照组、小AAA组和大AAA组的CD4+CD28-T细胞占CD4+淋巴细胞比例分别为3.87±0.73%,12.45±5.36%,8.77±3.01%。CD8+CD28-T细胞占CD8+淋巴细胞比例分别为3.93±0.56%,6.2±1.61%,5.8±2.3%。CD4+CD28-T细胞在三组间差异有显著性意义(F CD4+CD28-=14.49,P=0.000),其中以小腹主动脉瘤患者中升高最为明显(P<0.05)。CD8+CD28-T细胞在大AAA组与正常对照组间差异有显著意义(F CD8+CD28-=5.347, P=0.011),在其余二组组间差异无显著意义(P=0.000)。正常对照组、小AAA组和大AAA组的腹主动脉直径与CD4+CD28-及CD8+CD28-的相关性分别为(相关系数RCD4+CD28-=0.532, P=0.002;相关系数RCD8+CD28-=0.418,P=0.022)。2.T淋巴细胞的浸润在实验性AAA形成过程的作用2.1腹主动脉瘤大鼠模型的建立运用改良的肾下腹主动脉加压灌注弹力蛋白酶的方法建立AAA动物模型。术前各组(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)大鼠直径分别为1.11±0.13mm、1.12±0.15mm、1.13±0.05mm、1.12±0.16mm,比较各组大鼠术前直径差异无显著性意义(F=0.073,P>0.05)。取标本时各组大鼠腹主动脉扩张率的差异比较,正常对照组与术后3天组腹主动脉扩张率差异无显著性意义(F=141.25,P=0.771),其余各组比较其扩张率差异有显著性意义(F=141.25,P=0.000)。2.2各组大鼠腹主动脉形态学及组织学变化正常对照组腹主动脉大体形态无明显改变,术后3天腹主动脉开始扩张,术后7至14天腹主动脉呈加速扩张,术后14天腹主动脉瘤形成,局部动脉明显粘连、变硬。病理切片HE染色及EVG染色示：术后14天大鼠动脉内膜增厚,血管平滑肌细胞凋亡,中膜弹力纤维减少或消失。2.3 T淋巴细胞浸润在早期腹主动脉瘤形成中的作用正常对照组动脉未见明显的炎性细胞浸润。术后各组大鼠(术后3天、术后7天、术后14天)动脉中,T淋巴细胞分别20.20±11.89、39.60±15.29、165.40±44.22(F=88.58,P=0.000)；B淋巴细胞分别为10.40±3.92、14.0±5.63、52.10±22.76、(F=29.99,P=0.000)；巨噬细胞分别为7.70±2.58、8.20±3.05、28.90±15.98(F=17.50,P=0.000)。与正常对照组比较,术后14天组大鼠腹主动脉T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞表达有明显升高,差异有显著性意义。其中术后7天T淋巴细胞的表达即有显著升高(P=0.009),B细胞及巨噬细胞在术后7天有升高,但差异无显著意义(P>0.05)。提示T淋巴细胞的浸润及其所介导的炎症及免疫反应在腹主动脉瘤发病早期起着重要的触发作用。2.4各组大鼠血浆中CD4+、CD4+CD28-T淋巴细胞亚群检测各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)血液中CD4+亚群占T淋巴细胞比例为22±8.88%、25.6±6.32%、26.7±7.04%、27.4±4.17%(F=0.30,P=0.309),与正常对照组比较,术后各组大鼠血浆中CD4+占T淋巴细胞比例差异无显著性意义；各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)血液中CD4+CD28-占CD4+T比例为2.03±0.73%、4.16±1.31%、8.13±2.12%、5.63±1.23%(F=31.768,P=0.000),与正常对照组比较,各组大鼠血浆中CD4+CD28-比例差异有显著性意义(P<0.05),其中以术后7天大鼠血浆中CD4+CD28-比例最高(P<0.05)。提示T淋巴细胞亚群的分布变化及其所引起的炎症及免疫反应在腹主动脉瘤早期起着重要的触发及调节作用。3. Th1/Th2细胞因子及基质金属酶9基因表达与AAA形成的关系3.1各组大鼠血浆中Th1/Th2细胞因子的变化比较各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)血浆中IFN-γ浓度分别为30.04±11.18ng/L,37.88±11.86ng/L,52.18±17.72ng/L,77.69±19.71ng/L,正常对照组与术后3天组大鼠血浆中IFN-γ浓度差别无显著性意义(F=18.11,P=0.267),其余各组间差异有显著性意义(P<0.05)。显示随着腹主动脉直径的增加,各组大鼠血浆中IFN-γ的浓度呈显著增加。比较各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)血浆中IL-4浓度分别为24.15±10.74ng/L,27.45±9.02 ng/L,29.23±9.04 ng/L,29.95±9.15 ng/L。(F=0.738,P>0.05)。各组大鼠血浆中IL-4浓度有增加趋势,但差异无显著性。3.2荧光定量PCR检测各组大鼠腹主动脉IFN-γ、IL-4、MMP-9mRNA的表达比较各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)动脉中IFN-γmRNA含量分别为2.85±1.35,4.53±1.67,5.43±1.81,6.53±2.17,术后各组大鼠动脉中IFN-γmRNA与正常对照组差别有显著性意义(F=7.678,P<0.05),其余各组间差异无显著性意义(P>0.05)。比较各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)动脉中IL-4mRNA表达分别为3.58±1.68,4.52±1.92,5.77±2.07,8.72±2.84,与正常对照组比较,术后7天、14天组大鼠动脉中IL-4mRNA表达差异有显著意义(F=10.58,P<0.05),其余各组大鼠动脉中IL-4mRNA表达差异无显著意义(P>0.05)。各组大鼠(正常对照、术后3天、术后7天、术后14天)动脉中MMP-9mRNA表达分别为2.25±1.43,4.25±2.08,5.98±2.54,8.03±3.10,与正常对照组比较,术后7天及术后14天大鼠动脉中MMP-9mRNA表达差异有显著意义(F=10.82,P<0.05),其余各组大鼠动脉中MMP-9mRNA表达差异无显著意义(P>0.05)。经spearman相关分析,各组大鼠血管壁IFN-γ与MMP-9mRNA表达水平无明显相关性(相关系数r=0.329,P=0.038)。IL-4与MMP-9mRNA表达水平呈正相关性(相关系数r=0.74,P=0.000)。通过上述三个部分的实验,我们能够得出以下结论：1、AAA患者外周血及T淋巴细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α浓度明显升高,且AAA患者外周血中IFN-γ、TNF-α的浓度与腹主动脉直径呈正相关性。腹主动脉瘤患者处于炎症激活状态；2、在腹主动脉瘤患者外周血中CD4+CD28-细胞比例明显升高,以小腹主动脉瘤患者中升高更为显著。提示在早期腹主动脉瘤形成及发展中T淋巴细胞亚群比例明显变化,体内免疫反应处于被激活状态。3、弹力酶灌注可以诱导实验性腹主动脉瘤形成。采用改良的实验方法可形成稳定的腹主动脉瘤动物模型。炎症细胞的浸润及弹力纤维的断裂乃至消失是腹主动脉瘤形成的主要病理变化。腹主动脉壁T淋巴细胞的浸润是早期腹主动脉瘤形成过程中最重要的炎症细胞之一。T淋巴细胞的浸润及其亚群分布变化所致的免疫及炎症反应在腹主动脉瘤形成早期起着重要的触发及调节作用。4、Th1型细胞因子IFN-γ可能与早期腹主动脉炎症细胞的募集和浸润有关；Th2型细胞因子IL-4等在腹主动脉局部的聚集环境,可能诱导动脉局部基质金属酶活性增强,导致细胞外基质的病理性重构。伴随炎症因子浸润加重,动脉局部基质金属酶9分泌增多,中层弹力蛋白降解加剧,最终导致腹主动脉瘤的形成和扩张。5、针对不同时期的发病特点,通过对不同的T细胞亚群及IFN-γ、IL-4等细胞因子的进行调控,运用药物及基因手段调节免疫平衡治疗可能成为AAA治疗的的重要策略之一。

全文目录

摘要  3-11
ABSTRACT  11-23
前言  23-25
第一部分腹主动脉瘤患者外周血T淋巴细胞的激活及亚群的变化  25-53
  1.1 材料与方法  25-36
  1.2 结果  36-42
  1.3 讨论  42-45
  1.4 参考文献  45-53
第二部分 T淋巴细胞浸润在实验性AAA形成过程中的作用  53-74
  2.1 材料与方法  53-58
  2.2 结果  58-65
  2.3 讨论  65-70
  2.4 参考文献  70-74
第三部分 Th1/Th2细胞因子及基质金属酶9基因表达在AAA形成及扩张中的作用  74-93
  3.1 材料与方法  75-83
  3.2 结果  83-85
  3.3 讨论  85-89
  3.4 参考文献  89-93
结论  93-94
附录  94-96
文献综述  96-107
攻读学位期间成果  107-108
致谢  108-111
统计学证明  111-112

T淋巴细胞介导的免疫反应在腹主动脉瘤发病机制中的作用

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