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疣粒野生稻（Oryza granulata）内生真菌资源挖掘、系统发育分析和功能初探

作　者: 袁志林
导　师: 林福呈；章初龙
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 疣粒野生稻 内生真菌 生物多样性 系统发育分析 稻镰状瓶霉 产气霉
分类号: S511.9
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


非禾草内生麦角菌(non-clavicipitaceous grass endophytes)具有高度遗传多样性和功能多样性,已经成为当前菌物学研究的热点和主题。挖掘内生真菌资源对研究高等真菌生态学、进化机制等基础理论和应用开发均有重要的科学意义。从珍稀濒危植物或具有特殊进化历程、生存策略的植物中分离内生真菌极有可能获得种类新颖、功能特殊的宿主专一性类群。本篇论文对分布在云南西双版纳的濒临灭绝的禾本科植物—疣粒野生稻(Oryza granulata)的内生真菌资源进行了“生物勘探”。结合分离培养方法和免培方法,从形态水平(显微观察)、宏观生态水平(多样性参数计算和物种累加曲线预测)、生理水平(活体接种和活性测试)和分子水平(系统发育分析和环境PCR)等不同层次对疣粒野生稻内生真菌的种群结构组成、多样性特征、重要类群的系统发育关系和部分菌株的生物学功能进行了分析。在2007-2009年9月份,分别进行三次野外调查,共采集样品40株。主要结果：1)组织染色法证实了内生真菌菌丝在叶片和根系组织的分布,胞间或胞内定殖；根系中存在多种真菌侵染结构特征：“微菌核”(microsclerotia)可以充满单个皮层细胞或零星分布在多个细胞中,同时有大量暗色有隔菌丝平行分布在皮层细胞,这些特征表明了暗色有隔内生菌的存在(dark septate endophytes, DSEs);有些菌丝顶端细胞往往膨大、突起,形成不规则的类似附着孢的结构：此外还能观察到类似厚垣孢子的聚集。但是,并没有观察到典型菌根真菌的侵染结构。2)通过分离培养,共获得根系内生真菌菌株107株,茎杆74株和叶片组织78株(包括叶鞘)。利用经典形态学分类特征、“形态型”划分和分子生物学方法对菌株进行鉴定。结果表明,叶片组织内生真菌侵染频率相对较高(48.1%),其优势种群是炭角菌(Xylariaceae)和节菱孢霉(Arthrinium spp.);而根系和茎杆组织内生真菌侵染频率较低(分别为15.7%和11.7%)且没有明显的优势种群,绝大多数是单个种(singleton)。部分菌株在PDA或MEA培养基培养1-2周可产生无性态繁殖结构,包括Penicillium、Aspergillus、Cylindrocarpon、Fusarium、Phomopsis、Colletotrichum和Paecilomyces等；不产孢的菌株根据培养性状划分为多个“形态型”,然后对代表性菌株进行ITS序列测定,通过序列比对在GenBank数据库中获得最佳匹配记录,大致确定分类地位(目、科或属的水平)。BLAST结果表明很多菌株(尤其是茎内生菌)的ITS序列与已知菌物序列的相似度较低(83%-94%),可能代表了潜在的新种或更高的分类单元。从分类地位看,绝大多数菌株属于子囊菌门中的座囊菌纲(Dothideomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)和散囊菌纲(Eurotiomycetes)。根、茎和叶片组织内生真菌组成有明显差别,其中根系内生菌主要有座囊菌纲和散囊菌纲组成；茎内生菌主要由座囊菌纲和粪壳菌纲组成；而叶片内生菌主要由粪壳菌纲组成。此外也分离到4株担子菌,其中3株属于无致病性的双核丝核菌(Binucleate Rhizoctonia sp,有性阶段为Ceratobasidium)和1株小皮伞属(Marasmius)真菌。格孢腔目(Pleosporales)、巨座壳科(Magnaporthaceae)和节菱孢霉(Arthrinium)真菌在不同组织中均有分布而且基于ITS的系统发育分析也揭示了其种类丰富的特点。同时,野生稻内生真菌种群的年度变化很大,仅有少数种类重叠。3)利用环境PCR方法,提取根系总基因组DNA,利用真菌特异性引物ITS IF和ITS4扩增真菌ITS片段,进而建立ITS基因克隆库。最终获得186个阳性克隆(无嵌合体结构)的序列,以90%相似度为分类单元界限,可以分为35个系统发育型(phylotypes)。检测频率最高的克隆属于未知的担子菌(25.1%),而且60.2%的克隆序列最佳BLAST结果均与分类地位尚不明确的记录匹配。4)从根系中分离到两株巨座壳科真菌,通过比较产孢结构、分生孢子、培养性状等形态特征,并分析ITS系统发育树,将其定名为一新种—稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae Z.L. Yuan, C.L. Zhang & F.C. Lin, sp. nov.)。在1／2MS培养上,接种Harpophora oryzae可以显著促进栽培水稻的生长并提高其生物量,组织染色观察也证明H. oryzae能成功定殖在根系皮层细胞中。5)从茎杆中分离到两种Muscodor属(炭角菌科)真菌,这是首次在我国发现该属真菌。ITS、RPB2基因序列分析和系统发育结果表明,S13-1-2菌株与已报道的模式种M. albus(白色产气霉)序列100%相似；S18-3-1菌株的ITS序列与M. yucatanensis相似性有98%,但RPB2序列与M. albus的差异高达17%；而且在菌落特征、生长速度等方面与M. yucatanensis也有明显差别,因此将其定名为一新种—云南产气霉(Muscodor yunnanense Z.L. Yuan, C.L. Zhang & F.C. Lin, anam.sp.nov.)体外抑菌试验表明,M. albus S13-1-2和M. yunnanense S18-3-1能产生挥发性抑菌物质,对多种植物病原真菌的生长有强烈的抑制效果,甚至是致死作用。M. yunnanense S18-3-1的活性比M. albus S13-1-2更强。6)生物学功能初步分析表明,内生双核丝核菌R15-3-1预处理栽培水稻幼苗可以提高水稻对纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的抗病能力。结论概括与科学意义：1)疣粒野生稻根系和茎杆组织内生真菌多样性极其丰富。Exophiala、Cladophialophora、Periconia macrospinosa和Rhizoctonia等代表了根系潜在的DSEs,但需要进一步的试验证据证明；Harpophora oryzae可以作为栽培水稻根系的DSE；疣粒野生稻的内生真菌的遗传多样性比已报道的栽培稻品种要丰富,表明在原产地野生状态下的植物可能蕴含物种更丰富、更新颖的功能性菌株。2)根系染色观察和PCR方法均未检测到菌根真菌的存在,至少说明在某些特定生境下,内生真菌扮演着与菌根真菌同等重要的角色。3)格孢腔内生真菌在草本植物中(也包括禾本科植物)较常见；巨座壳和节菱孢霉在禾本科植物中更为普遍,显示内生真菌在种类组成具有一定的宿主特异性(至少在植物“科”的水平上)。而且其中一部分菌株很可能代表了新的分类地位,这对于相关类群的进化生物学与整体系统生物学研究具有重要的参考价值。4)“单个种”或稀有种在根系和茎杆组织中较为常见,这些种类并非是由于样品数量、随机侵染宿主或操作污染造成的,而是严格意义上的“真正内生菌”(true endophytes),与宿主经历了长期的协同进化(不具有强致病性),因此在分析内生真菌生物多样性或功能多样性时,不应该将这些种类剔除或忽略。5)内生真菌种群具有明显的年度变化,因此在系统挖掘某一类植物内生真菌资源时,在不同年份、不同生长季节分别取样有可能获得更丰富的内生真菌类群,从而有助于更清晰认识植物内生真菌的一系列基础生物学特性。6)环境PCR方法通常能检测到更多的担子菌,而培养方法获得的菌株绝大多数属于子囊菌。因此常规分离培养方法获得的类群并不能反映植物内生真菌种群结构的真正面貌,可以尝试采用不同的分离方法、培养技术来“捕获遗漏的真菌”。7)产气霉Muscodor可能有更广的地理分布范围,从高纬度植物中寻找更多新的产气霉种类对全面认识这种特殊的严格内生菌的生态、进化等有重要科学意义。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-16
第一章 文献综述  16-62
  1 内生真菌的定义、分类及"生物勘探"概况  16-20
    1.1 内生真菌的定义及其与菌根真菌的区别  16-17
    1.2 内生真菌的分类  17-18
    1.3 内生真菌生物勘探研究概况  18-20
  2 全球真菌多样性概况  20
  3 植物内生真菌的种类组成  20-21
  4 内生真菌种群结构特征、总体分布格局和多样性特点  21-28
    4.1 内生真菌分布的一般特点  21-22
    4.2 DSEs根系内生真菌的一般生物学特征  22-24
    4.3 兰科植物根系内生真菌  24-25
    4.4 叶片内生真菌种群结构和整体分布格局  25-28
  5 植物与内生真菌互作的生理与分子机制  28-42
    5.1 内生真菌种群结构是否促进植物进化  29
    5.2 内生真菌侵染宿主的形态学、生理学机制及双方各自的生理反应  29-31
    5.3 内生真菌改变植物生理代谢并增强宿主抗逆性的现象和机制分析  31-37
    5.4 内生真菌—植物互作体系中的重要分子元件及调控机制  37-38
    5.5 内生真菌对宿主表型的可塑性  38-39
    5.6 菌根真菌、内生真菌和植物三者之间的关联  39-41
    5.7 真菌病毒和细菌在内生真菌—植物互作过程中的可能角色  41
    5.8 展望  41-42
  6 植物内生真菌染色观察、分离培养鉴定和分子检测  42-56
    6.1 显微镜法直接观察内生真菌在宿主组织中的侵染结构和分布特征  42-44
    6.2 内生真菌分离培养技术  44-50
    6.3 内生真菌的鉴定方法  50-52
    6.4 环境PCR方法(免培方法)研究内生真菌的生物多样性  52-56
  7 内生真菌与寄主植物互作研究中的一般原则和方法  56-60
    7.1 研究内生真菌与植物互作模型中植物与真菌材料的选择  57
    7.2 筛选功能性内生真菌应用于农作物的几个原则  57-58
    7.3 植物与内生真菌互作研究中的技术和方法  58-60
  8 本研究的立题依据、研究目的和研究内容  60-62
第二章 疣粒野生稻内生真菌的组织学观察  62-69
  1 材料和方法  62-63
    1.1 样品采集和生境特点  62
    1.2 样品前处理  62
    1.3 光学显微镜染色观察  62-63
    1.4 低温冷冻扫描电镜观察法  63
  2 结果和讨论  63-69
    2.1 疣粒野生稻生境特点  63-64
    2.2 光学显微镜、扫描电镜观察植物组织内的内生真菌  64-69
第三章 疣粒野生稻内生真菌的分离培养、鉴定和多样性分析  69-93
  1 材料方法  69-72
    1.1 样品采集和前处理  69
    1.2 内生真菌分离培养  69-70
    1.3 内生真菌形态学、分子生物学鉴定  70-71
    1.4 内生真菌菌株保存  71
    1.5 相关类群真菌的分子系统发育分析  71-72
    1.6 内生真菌生物多样性评价:生态学参数计算及物种累加曲线预测  72
  2 结果与分析  72-89
    2.1 疣粒野生稻内生真菌的种类组成、种群结构和年度变化  72-83
    2.2 疣粒野生稻内生真菌生物多样性参数计算及物种累加曲线预测  83-89
  3 讨论  89-93
第四章 结合培养和环境PCR方法评价疣粒野生稻根系内生真菌的多样性特征  93-107
  1 材料方法  93-96
    1.1 样品采集及分离培养内生真菌(同第二章内容)  93
    1.2 根系样品制备及总基因组提取  93-94
    1.3 筛选扩增植物基因组中真菌特异性ITS片段的引物  94-95
    1.4 内生真菌ITS片段克隆库构建  95
    1.5 克隆序列和系统发育分析  95-96
    1.6 多样性参数计算及物种累加曲线预测  96
  2 结果与分析  96-98
    2.1 PCR扩增根系基因组中真菌特异性ITS片段及克隆库构建  96-97
    2.2 克隆序列及系统发育分析  97-98
    2.3 比较培养方法、直接PCR方法对根系内生真菌生物多样性的评价  98
  3 讨论  98-107
第五章 疣粒野生稻内生真菌两新种鉴定  107-124
  第一节 疣粒野生稻根系内生真菌一新种—稻镰状瓶霉  107-115
    1 研究材料和方法  107
      1.1 内生真菌纯培养物  107
      1.2 形态学观察及系统发育分析  107
    2 结果与分析  107-111
      2.1 稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)与巨座壳科(Magnaporthaceae)相关属真菌的系统发育分析  107-109
      2.2 稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)的基本培养性状和形态学特征  109-111
    3 讨论  111-115
  第二节 疣粒野生稻茎杆内生真菌一新种—云南产气霉  115-124
    1 研究材料和方法  115-116
      1.1 内生真菌纯培养物  115
      1.2 形态学特征  115
      1.3 分子系统发育分析  115-116
    2 结果与分析  116-119
      2.1 云南产气霉(Muscodor yunnanense)培养性状与特征  116-117
      2.2 云南产气霉菌株的分子系统发育分析  117-119
    3 讨论  119-124
第六章 稻镰状瓶霉、产气霉和无毒双核丝核菌生物学功能的初步研究  124-135
  1 研究材料和方法  124-126
    1.1 内生真菌菌株  124
    1.2 稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)与栽培水稻(Oryza sativa L.)的共培养体系建立及其对水稻幼苗的促生效应  124-125
    1.3 产气霉(Muscodor spp.)产生的挥发性气体的抑菌活性评价  125
    1.4 用固相微萃取(SPME)与气相色谱、质谱(GC-MS)联用分析产气霉的抑菌气体成分  125-126
    1.5 无毒双核丝核菌(Rhizoctonia sp.)抗水稻纹枯病菌体外接种试验  126
  2 结果分析  126-128
    2.1 稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)对栽培水稻的促生效应  126-128
    2.2 产气霉(Muscodor spp.)产生的挥发性气体及其抑菌活性分析  128
    2.3 无毒双核丝核菌(Rhizoctonia sp.)抗水稻纹枯病菌  128
  3 讨论  128-135
第七章 全文总结、今后工作与展望  135-140
  1 全文总结  135-137
  2 今后拟开展的工作  137-140
    2.1 稻镰状瓶霉功能基因组学研究  137
    2.2 优化分离培养体系获得种类更丰富的野生稻内生真菌  137-138
    2.3 建立一套简易的鉴定内生真菌诱导水稻产生抗性的技术方法  138
    2.4 产气栎生青霉(Penicillium glandicola)的生态学功能研究  138-140
参考文献  140-176
附录  176-177
致谢  177

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻 > 野生稻
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