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BuforinⅡ抗菌肽的分子设计及对DNA作用抑菌机理研究

作　者: 郝刚
导　师: 乐国伟
学　校: 江南大学
专　业: 食品营养与安全
关键词: 抗菌肽 BuforinⅡ 衍生物抑菌机理 DNA 细胞膜
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

抗菌肽的研究有几十年的历史,而各国学者研究抑菌机理主要集中在膜作用机制上。有些抗菌肽并不破坏膜结构,而是直接穿过胞膜,作用于胞内靶点,这可能就是其胞内分子作用抑菌机制。分离自蟾蜍胃组织中的抗菌肽BuforinⅡ能穿透细胞膜,直接作用于胞内DNA。不同于作用膜的抗菌肽,DNA作用抗菌肽有其独特的抑菌机制,但它的具体抑菌模式仍不清楚,值得我们去深入研究。本文在BuforinⅡ衍生肽BF2-A的结构特征基础上,设计合成了一个新肽BF2-X。BF2-X是将BF2-A的N-端保持不变,在第十位精氨酸上接入一个三次重复的α-螺旋序列RLLR,并将第8位上的缬氨酸用亮氨酸取代。经生物信息学软件分析,两个阳离子肽都没有跨膜区,与BF2-A相比,BF2-X的螺旋度与正电荷增加,疏水性比例提高,C-端两亲性增强。当置于疏水环境中时,BF2-A/X会由自由卷曲结构诱导成α-螺旋结构,且BF2-X的α-螺旋含量高于BF2-A。它们对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌以及白色念珠菌等真菌有广谱的抗菌活性,BF2-X对细菌的抗菌活性强于BF2-A,其对大肠杆菌和金葡菌的抗菌活性是BF2-A的两倍。BF2-X杀菌比BF2-A快速,浓度的提高明显增强BF2-X的抗菌活性,而BF2-A不是浓度依赖性的抗菌肽。两个抗菌肽没有体外溶血活性,也没有细胞毒性,能结合脂多糖中和内毒素,对热稳定,最适pH为中性。BF2-A/X对胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶具有抵抗力,但不能抵抗蛋白酶K的酶解,也不耐受高离子强度溶液。BF2-X引起脂质体包裹的荧光染料的泄漏是浓度依赖性的,其泄漏率比BF2-A高,但它们都不能使脂质体膜破裂。BF2-A能增加G-菌外膜的渗透性但不能增加细菌质膜的通透性,BF2-A能引起钾离子泄漏,但它处理后的细菌胞膜保持完整。BF2-X能增加细菌外膜、质膜渗透性,5MIC时还能诱导胞内大分子的轻微泄漏。BF2-X对细菌胞膜的通透作用比BF2-A大,引起钾离子泄漏量略多于BF2-A,但它并不崩塌细胞膜。由于提高了C-端的螺旋度和疏水性,无论对G-菌还是G+菌,BF2-X穿透细胞质膜的效率都要比BF2-A高。BF2-A/X能够进入大肠杆菌细胞内累积,其作用靶标是DNA/RNA,但它们都不能断裂基因组DNA,而是结合DNA和RNA。螺旋度和疏水性的增强使BF2-X结合DNA的能力比BF2-A强,但BF2-A结合RNA的能力却比BF2-X强。BF2-A/X能利用静电吸引结合到DNA上,能够插入到DNA双螺旋的沟槽中使双螺旋结构变得松散,还能嵌入DNA碱基对间,削弱碱基对间的π-π堆积作用。BF2-X还能使DNA从B构型往C构型转变,它插入DNA的沟槽及嵌入碱基对的能力比BF2-A强。BF2-A/X趋向与大肠杆菌基因组DNA上的两个区段进行特异性结合,其中一个区段是23S rRNA基因上的一段保守序列。BF2-A/X结合DNA和RNA后首先影响的不是DNA的复制功能,而是基因的转录功能,它们优先抑制RNA的合成而不是DNA的合成。BF2-X抑制DNA和RNA合成的能力都比BF2-A强。两个抗菌肽还能优先抑制蛋白的合成,BF2-A抑制蛋白合成的能力则比BF2-X强。抗菌肽还能影响细胞的氧化磷酸化过程,显著抑制细菌的呼吸作用和ATP的合成,其中BF2-X的抑制比BF2-A更强烈。BF2-A/X通过影响细胞能量代谢的方式,进一步影响蛋白和核酸的生物合成。本文研究比较了BF2-A/X的抗菌机理以及构效关系,发现它们不破裂细胞膜,而是进入胞质结合DNA和RNA达到抑菌目的。与BF2-A不同,BF2-X是个浓度依赖性抗菌肽,由于提高了其C-端的疏水性比例与螺旋度,它增加了质膜的渗透性,使其穿透细胞膜的效率较高,结合DNA的能力更强,抑制DNA和RNA合成的能力也更强,这就是它抗菌活性比BF2-A强,杀菌迅速的原因。本文的研究结果将为我们更好地了解和利用这类DNA作用抗菌肽奠定坚实的基础。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章绪论  13-26
  1.1 抗菌肽的生物学活性  13
  1.2 抗菌肽的理化性质及结构特征  13-15
  1.3 抗菌肽的应用前景  15
  1.4 抗菌肽的抑菌作用机理  15-17
    1.4.1 作用于微生物细胞膜的杀伤机制  15-16
    1.4.2 抑制细胞的呼吸作用  16
    1.4.3 抑制细胞壁形成  16-17
    1.4.4 通过非膜性的外部靶点发挥作用  17
    1.4.5 作用胞内生物大分子  17
  1.5 抗菌肽的构效关系及分子设计  17-20
    1.5.1 抗菌肽的结构和活性关系  17-19
    1.5.2 抗菌肽基于膜作用的分子设计  19-20
  1.6 抗菌肽Buforin的研究进展  20-21
  1.7 本论文的研究内容及思路  21-22
  参考文献  22-26
第二章 Buforin Ⅱ衍生肽的分子设计和结构预测  26-36
  2.1 引言  26-27
  2.2 实验材料  27
    2.2.1 分析工具  27
    2.2.2 主要试剂  27
  2.3 实验方法  27-28
    2.3.1 抗菌肽的物理化学特性分析  27
    2.3.2 二级结构分析  27
    2.3.3 跨膜预测  27-28
    2.3.4 疏水性及C-端两亲性分析  28
    2.3.5 空间结构模拟  28
    2.3.6 抗菌肽的固相合成  28
    2.3.7 圆二色谱测定  28
  2.4 结果与讨论  28-34
    2.4.1 抗菌肽BF2-X的设计  28
    2.4.2 抗菌肽BF2-A/X的物理化学特性分析  28-29
    2.4.3 二级结构分析  29-30
    2.4.4 跨膜预测  30-31
    2.4.5 肽的疏水性及C-端两亲性分析  31-32
    2.4.6 抗菌肽的空间结构模拟  32
    2.4.7 圆二色谱  32-34
  2.5 本章小结  34
  参考文献  34-36
第三章抗菌肽BF2-A/X的生物活性和物化特性研究  36-50
  3.1 引言  36
  3.2 实验材料  36-37
    3.2.1 菌株  36
    3.2.2 培养基  36-37
    3.2.3 主要试剂  37
  3.3 实验方法  37-39
    3.3.1 微生物的培养  37
    3.3.2 抗菌活性测定方法  37-38
    3.3.3 抗菌肽BF2-A/X的抗菌活性测定  38
    3.3.4 抗菌肽对细菌生长的影响  38
    3.3.5 抗菌肽体外溶血实验  38
    3.3.6 抗菌肽抑制肿瘤细胞Hep-G2体外增殖的活性  38-39
    3.3.7 抗菌肽结合脂多糖中和内毒素的活性  39
    3.3.8 抗菌肽BF2-A/X稳定性检测  39
  3.4 结果与讨论  39-47
    3.4.1 抗菌肽BF2-A/X的抗菌活性检测  39-40
    3.4.2 抗菌肽对细菌生长的影响  40-41
    3.4.3 抗菌肽体外溶血活性  41-42
    3.4.4 抗菌肽抑肿瘤细胞活性  42-43
    3.4.5 抗菌肽中和内毒素的活性  43
    3.4.6 抗菌肽的稳定性研究  43-47
  3.5 本章小结  47-48
  参考文献  48-50
第四章抗菌肽BF2-A/X对细菌细胞膜作用机制的研究  50-65
  4.1 引言  50
  4.2 实验材料  50-51
    4.2.1 培养基与缓冲液  50
    4.2.2 主要试剂  50-51
  4.3 实验方法  51-53
    4.3.1 抗菌肽对细菌细胞表面特性的影响  51
    4.3.2 抗菌肽与脂质体的相互作用  51-52
    4.3.3 抗菌肽对G-菌外膜的渗透性  52
    4.3.4 抗菌肽对细胞质膜的渗透性  52-53
    4.3.5 抗菌肽引起胞内K+的泄漏  53
    4.3.6 透射电镜观察抗菌肽对细菌胞膜的影响  53
    4.3.7 流式细胞仪分析细菌胞膜完整性  53
    4.3.8 抗菌肽BF2-A/X穿透细菌胞膜效率的比较  53
  4.4 结果与讨论  53-63
    4.4.1 抗菌肽对细菌细胞表面特性的影响  53-54
    4.4.2 抗菌肽与脂质体的相互作用  54-57
    4.4.3 抗菌肽对G-菌外膜的渗透性  57
    4.4.4 抗菌肽对细胞内膜的渗透性影响  57-59
    4.4.5 抗菌肽引起的细菌胞内离子泄漏  59
    4.4.6 透射电镜观察抗菌肽对细菌胞膜的影响  59-60
    4.4.7 流式细胞仪分析细菌胞膜完整性  60-61
    4.4.8 抗菌肽BF2-A/X穿透细菌胞膜效率的比较  61-63
  4.5 本章小结  63
  参考文献  63-65
第五章抗菌肽BF2-A/X对细菌DNA作用机制的研究  65-79
  5.1 引言  65
  5.2 实验试剂  65-66
  5.3 实验方法  66-69
    5.3.1 抗菌肽在大肠杆菌细胞里的累积  66
    5.3.2 抗菌肽与细菌作用后对基因组DNA的影响  66
    5.3.3 DNA-肽结合凝胶阻滞实验  66-67
    5.3.4 RNA-肽结合凝胶阻滞实验  67
    5.3.5 原子力显微镜扫描抗菌肽与DNA 的结合  67-68
    5.3.6 圆二色谱检测结合肽后DNA的结构  68
    5.3.7 抗菌肽与EB竞争性结合DNA的荧光光谱分析  68
    5.3.8 磷酸盐溶液对抗菌肽与DNA 相互作用的影响  68
    5.3.9 抗菌肽与DNA的特异性结合研究  68-69
  5.4 结果与讨论  69-77
    5.4.1 抗菌肽在大肠杆菌细胞里的累积  69-70
    5.4.2 抗菌肽与细菌作用后对基因组DNA的影响  70
    5.4.3 DNA-肽结合凝胶阻滞实验  70-71
    5.4.4 RNA-肽结合凝胶阻滞实验  71
    5.4.5 原子力显微镜扫描抗菌肽与DNA 的结合  71-73
    5.4.6 DNA的圆二色谱图  73-74
    5.4.7 抗菌肽与EB竞争性结合DNA的荧光光谱分析  74-75
    5.4.8 磷酸盐溶液对抗菌肽与DNA 相互作用的影响  75-76
    5.4.9 抗菌肽与DNA的特异性结合研究  76-77
  5.5 本章小结  77-78
  参考文献  78-79
第六章抗菌肽BF2-A/X作用细菌后对生理代谢的影响  79-88
  6.1 引言  79
  6.2 主要试剂  79-80
  6.3 实验方法  80-82
    6.3.1 抗菌肽作用大肠杆菌后对细胞DNA合成能力的影响  80
    6.3.2 抗菌肽作用大肠杆菌后对细胞RNA合成能力的影响  80
    6.3.3 抗菌肽作用大肠杆菌后对细胞总蛋白合成能力的影响  80-81
    6.3.4 抗菌肽作用细菌后对β-半乳糖苷酶表达活性的影响  81
    6.3.5 抗菌肽作用细菌后对碱性磷酸酶表达活性的影响  81
    6.3.6 抗菌肽作用细菌后对细胞呼吸作用的影响  81
    6.3.7 抗菌肽作用细菌后对细胞ATP生产的影响  81-82
  6.4 结果与讨论  82-86
    6.4.1 抗菌肽作用细菌后对DNA合成的影响  82
    6.4.2 抗菌肽作用细菌后对RNA合成的影响  82-83
    6.4.3 抗菌肽作用细菌后对总蛋白合成能力的影响  83-84
    6.4.4 抗菌肽作用细菌后对β-半乳糖苷酶表达活性的影响  84
    6.4.5 抗菌肽作用细菌后对碱性磷酸酶表达活性的影响  84-85
    6.4.6 抗菌肽作用细菌后对细胞呼吸作用的影响  85
    6.4.7 抗菌肽作用细菌后对细胞产ATP的影响  85-86
  6.5 本章小结  86-87
  参考文献  87-88
论文结论与创新点  88-90
  一、论文主要结论  88-89
  二、论文创新点  89-90
致谢  90-91
攻读博士学位期间发表论文清单  91-92
附录  92-93

BuforinⅡ抗菌肽的分子设计及对DNA作用抑菌机理研究

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