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跨膜型TNF-α反向信号通路及其保护肿瘤抵抗凋亡的分子机制

作　者: 严丹
导　师: 李卓娅
学　校: 华中科技大学
专　业: 分子免疫学
关键词: 跨膜型肿瘤坏死因子-α 反向信号 TRAF1 IKKα NF-κBp52 肿瘤耐药
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α, tmTNF-α)不但可作为配体与靶细胞TNFR结合,向靶细胞传递正向信号,对靶细胞发挥效应；也可作为受体与可溶性或膜TNFR结合,向效应细胞本身传递反向信号,介导效应细胞的生物学效应。tmTNF-α反向信号可上调活化T细胞分泌IFN-γ,下调IL-4的产生；可抑制LPS诱导的单核细胞分泌致凋亡因子和促炎细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6等,但却上调IL-12的产生。此外,tmTNF-α反向信号还可诱导HTLV感染的T细胞系或PHA活化的CD4+T细胞表达E-selectin。本室前期工作证实肿瘤细胞高表达tmTNF-α可通过其反向信号保护肿瘤细胞抵抗分泌性TNF-α(secretory TNF-α, sTNF-α)诱导的凋亡。但是对其反向信号通路却知之甚少。本实验室前期用自己制备的特异性针对tmTNF-α抗体进行免疫共沉淀,沉淀到与tmTNF-α胞内段发生作用的IKKa、TRAF1和NF-κBp52。本研究主要探讨tmTNF-α反向信号复合物成员之间的相互作用,该复合物与线粒体之间的联系,以及tmTNF-α与肿瘤耐药的关系并深入探索其分子机制,为临床干预肿瘤耐药提供新的分子靶点和理论依据。主要实验结果如下：一、TNF-LS、IKKα和TRAF1原核表达、真核表达和荧光融合表达载体的构建和鉴定1. TNF-LS、IKKα和TRAF1原核表达、真核表达和荧光融合表达载体的构建和鉴定：用PCR和分子克隆技术成功构建pTriEx-4C-TNF-LS、pTriEx-4C-TRAF1、pTrieX-4C-IKKα、pET28a-his-TRAF1和pET28α-his-IKKα原核表达重组体；pEGFPN1-TNF-LS、pDsRedN1-TNF-LS、pCFPN1-TNF-LS和pEGFPC1-IKKα等荧光融合表达载体；pTriEx-4C-TNF-LS、pTriEx-4C-TRAF1、pTriEx-4C-IKKα、pcDNA3.1-IKKα等真核表达载体。2. TNF-LS缺失突变体的构建和鉴定：用重组PCR定位突变技术成功构建了△-75～-69-TNFLS和△-68～-62-TNFLS突变体,并分别连接至pcDNA3.1和pEGFPN1载体上。二、tmTNF-α反向信号复合物主要成员TNF-LS、TRAF1与IKKα的细胞亚定位和相互关系的确定1. tmTNF-α与IKK-α, TRAF-1和NF-κBp52发生共沉淀：采用仅识别tmTNF-α的单克隆抗体进行IP-Wetern,结果可共沉淀TRAF1、IKKα和NF-κBp52,但不能与TNFR1/2、TRAF2/3、NIK、SODD、FADD和NF-κBp65等分子共沉淀。反之,分别用TRAF1、IKKα和NF-κBp52抗体可与tmTNF-α共沉淀。提示TRAF-1、IKKα和NF-κBp52可能与tmTNF-α胞浆段形成信号复合物参与NF-κB的活化。2. TNF-LS与TRAF1直接相互作用：用体外Pull down证实了TRAF1和TNF-LS可直接相互作用；共转染TRAF1和tmTNF-α或TNF-LS可共沉淀到大量TRAF1,当TRAF1与缺失胞浆段的tmTNF-α共转,则不能募集TRAF1;此外,共转TRAF1和TNF-LS可使在原本胞膜周围弥散性分布的TNF-LS改变为与TRAF1共定位,且呈局限性聚集。3. TNF-LS N端的-75～-69位氨基酸决定了TRAF1和TNF-LS的相互作用：共转△-75～-69-TNF-LS和TRAF1,并不能导致共沉淀的TRAF1增加,提示该位点可能为募集TRAF1所必需。4. TRAF1与IKKα直接相互作用：用体外Pull down证实TRAF1可与IKKα直接相互作用。共转TRAF1和IKKα使共沉淀的IKKα量明显高于单转TRAF1或者IKKα,并使胞浆内弥散性分布的IKKα向TRAF1分布的地方聚集。5. TNF-LS不能与IKKα直接相互作用：用体外Pull down实验证实TNF-LS和IKKα之间无直接相互作用。6.抑制CKI对tmTNF-α胞内段磷酸化导致反向信号复合物募集,NF-κB活化,并减低对ADM和sTNF-α杀伤的敏感性：用CKI抑制剂D4476抑制CKI对tmTNF-α-75～-69位点的磷酸化,促进tmTNF-α与TRAF1、IKKα和NF-κBp52形成复合物增多,NF-κB进一步活化,并保护肿瘤细胞抵抗sTNF-α和阿霉素诱导的凋亡。三、tmTNF-α反向信号复合物与线粒体的关系1. TRAF1诱导线粒体聚集,并和线粒体共定位：293T细胞线粒体呈点网状分布,转染TRAF1后,线粒体呈局限性点状分布,且和TRAF1共定位。2. tmTNF-α反向信号复合物存在于线粒体：提取线粒体蛋白,用Western blot证实在线粒体中可检测到tmTNF-α及其反向信号复合物成员TRAF1、IKKα和NF-κBp52；共转293T细胞TNF-LS和TRAF1可导致线粒体聚集,且聚集的线粒体与TNF-LS和TRAF1发生共定位；用IP证实tmTNF-α和NF-KBp52可在线粒体中发生免疫共沉淀,提示tmTNF-α反向信号复合物可能存在于线粒体中。3. tmTNF-α及其反向信号复合物成员可在胞核中检出：提取核蛋白,用Western blot在核蛋白中检出完整的tmTNF-α分子及其反向信号复合物成员TRAF1、IKKα和NF-κBp52,但是,它们与tmTNF-α之间的关系尚待研究。四、高表达TNF-LS诱导MCF-7细胞抵抗sTNF-α的胞毒作用1.高表达tmTNF-α保护乳腺癌细胞抵抗sTNF-α的胞毒效应：高表达tmTNF-α的MDA-MB-231乳腺癌细胞NF-κB持续性活化,对sTNF-α导致的胞毒效应发生抵抗；而低表达tmTNF-α的MCF-7乳腺癌细胞NF-κB无激活,且对sTNF-α胞毒效应敏感。2.下调tmTNF-α可逆转MDA-MB-231细胞对sTNF-α的敏感性：用siRNA下调MDA-MB-231细胞tmTNF-α的基因表达,可抑制NF-κB活化,逆转其对sTNF-α杀伤的敏感性。3.稳转TNF-LS使MCF-7细胞由sTNF-α敏感株变为耐受株：稳转TNF-LS的MCF-7细胞高表达TNF-LS,且TNF-LS主要分布在胞膜上；稳转TNF-LS使MCF-7细胞NF-κB持续性活化,并由sTNF-α敏感细胞株转变为耐受株。用PDTC抑制NF-κB活化,可抑制抗凋亡分子cIAP1的基因表达,并逆转稳转TNF-LS的MCF-7细胞对sTNF-α的敏感性。4. TNF-LS介导tmTNF-α的反向信号：瞬转TNF-LS和wt-tmTNF-α均可导致NF-κB活化,对sTNF-α胞毒效应耐受；而瞬转缺失胞浆段的△cs-tmTNF-α则几乎不引起NF-κB活化,并保留亲本细胞对sTNF-α的敏感性。提示TNF-LS介导tmTNF-α的反向信号。5.抑制TNF-LS内吞促进MCF-7细胞对sTNF-α的耐受：用MDC抑制内吞可增加细胞表面TNF-LS的表达,导致NF-κB活性进一步增加,使MCF-7细胞对sTNF-α的耐受增强。提示tmTNF-α的反向信号不需要该分子内化。6.抑制TNF-LS胞浆段剪切促进MCF-7细胞对sTNF-α的耐受：用ZLL抑制信号肽肽酶对TNF-LS胞浆段的剪切,也可进一步增加TNF-LS在细胞表面的表达,进而促进NF-κB活化,增强MCF-7细胞对sTNF-α的耐受。提示tmTNF-α的反向信号依赖其跨膜性。五、tmTNF-α反向信号诱导乳腺癌细胞抵抗化疗及其分子机制1.高表达tmTNF-α导致乳腺癌细胞卡铂耐药：用胞毒实验证实高表达tmTNF-α乳腺癌细胞系MDA-MB-435抵抗卡铂杀伤效应,其NF-κB组成性活化；而低表达tmTNF-α乳腺癌细胞系T47D的NF-κB无活化,对卡铂杀伤则敏感。瞬转tmTNF-α可明显抑制T47D细胞对卡铂的敏感性,用PDTC抑制NF-κB活性则能在一定程度上逆转该转染细胞对卡铂的敏感性。2. tmTNF-α反向信号与乳腺癌细胞耐药相关：比较3株稳转缺失胞外段的TNF-LS的MCF-7细胞,因TNF-LS表达量不同而对卡铂的敏感性不同,即TNF-LS表达量越高的MCF-7细胞对卡铂的敏感性越差(IC50>400μg/ml),而亲本MCF-7细胞的IC50则为231μg/ml。用PDTC特异性抑制NF-κB的活性,可以在一定程度上逆转高表达TNF-LS的MCF-7细胞对卡铂的敏感性。提示tmTNF-α反向信号与乳腺癌细胞耐药相关。3. tmTNF-α反向信号导致ERK组成性磷酸化：转染tmTNF-α可导致T47D细胞ERK组成性磷酸化增加,卡铂对其无明显影响；但是卡铂可明显诱导未转染T47D细胞ERK的磷酸化。4. tmTNF-α反向信号抑制卡铂诱导的JNK磷酸化：卡铂作用T47D细胞可诱导JNK一过性磷酸化；然而,转染tmTNF-α可明显抑制卡铂诱导JNK的磷酸化。提示tmTNF-α反向信号抑制JNK磷酸化,从而抵抗卡铂的胞毒效应。5. tmTNF-α反向信号导致PI3K组成性表达：卡铂作用T47D细胞可诱导PI3K亚单位p85微量表达；转染tmTNF-α则导致T47D细胞PI3K高水平组成性表达,但卡铂对其无明显影响。提示tmTNF-α反向信号诱导PI3K组成性活化,可能通过促进抗凋亡因子表达而抵抗卡铂的胞毒效应。6. tmTNF-α反向信号诱导p53组成性表达：卡铂作用T47D细胞可诱导p53高表达,而转染tmTNF-α则导致T47D细胞p53高水平组成性表达,卡铂对之无明显影响。提示tmTNF-α反向信号诱导p53组成性高表达,可能通过增强DNA修复,抵抗卡铂造成DNA损伤而导致的细胞凋亡。综上所述,本工作阐明了tmTNF-α反向信号复合物成员的相互作用,即通过其胞浆段脱磷酸化,募集TRAF1,后者将IKK-α募集到tmTNF-α反向信号复合物中,活化NF-κB旁路,通过上调抗凋亡基因表达,导致肿瘤细胞抵抗sTNF-α和化疗药物的杀伤。此外,tmTNF-α反向信号还通过促进肿瘤细胞PI3K和p53组成性表达,诱导ERK组成性磷酸化,抑制卡铂诱导的JNK磷酸化而导致肿瘤细胞耐药。该研究通过深入探索tmTNF-α反向信号通路及其保护肿瘤抵抗凋亡的分子机制,为临床干预肿瘤耐药提供新的线索和分子靶点。

全文目录

缩略词表  6-10
中文摘要  10-15
ABSTRACT  15-25
第一部分跨膜TNF-α反向信号通路起始复合物主要组成成员TNF-LS、TRAF1和IKKα重组蛋白的构建与鉴定  25-55
  前言  25-26
  材料与方法  26-34
  结果  34-51
  讨论  51-54
  小结  54-55
第二部分跨膜TNF-α反向信号复合物主要成员TNF-LS、TRAFl与IKKα的细胞亚定位及其相互关系的研究  55-93
  前言  55-56
  材料与方法  56-74
  结果  74-87
  讨论  87-92
  小结  92-93
第三部分 tmTNF-α反向信号复合物成员TNFLS、TRAF1和IKKα与线粒体的关系  93-104
  前言  93-94
  材料和方法  94-96
  结果  96-100
  讨论  100-103
  小结  103-104
第四部分高表达TNF-LS诱导MCF-7细胞抵抗sTNF-α的胞毒作用  104-129
  前言  104-105
  材料和方法  105-111
  结果  111-125
  讨论  125-127
  小结  127-129
第五部分 tmTNF-α反向信号诱导乳腺癌细胞抵抗化疗及其分子机制  129-148
  前言  129-130
  材料和方法  130-132
  结果  132-143
  讨论  143-146
  小结  146-148
全文小结  148-150
参考文献  150-169
综述线粒体对细胞凋亡的调控  169-186
附录攻读博士学位期间已发表的学术论文目录  186-187
致谢  187

跨膜型TNF-α反向信号通路及其保护肿瘤抵抗凋亡的分子机制

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