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放射性核素~(99m)Tc标记新型凋亡显像分子探针Tat_(49-57)-DEVD的实验研究

作 者: 常伟
导 师: 高再荣
学 校: 华中科技大学
专 业: 影像医学与核医学
关键词: Caspase-3酶 穿膜肽 同位素标记 单光子发射式计算机断层 凋亡显像
分类号: R817
类 型: 博士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


研究99mTc标记穿膜肽HIV-Tat49-57修饰的Caspase-3底物多肽Tat49-57-DEVD的制备方法;及其体外人乳腺癌MCF-7细胞经环磷酰胺诱导的肿瘤细胞凋亡凋亡模型中标记物摄取动力学实验;以及在正常昆明小鼠体内的生物学分布特征;并进一步结合单光子发射计算机断层(SPECT)显像技术,评价其应用于在荷瘤裸鼠模型活体内实时、动态地检测靶组织细胞凋亡程度的可行性研究。方法1.99mTc-HYNIC-HIV-Tat-DEVD标记条件和生物分布的研究:(1)多肽探针标记条件的研究:合成穿膜肽HIV-Tat49-57修饰的Caspase-3底物多肽Tat49-57-DEVD,以双功能联结剂联肼尼克酰胺(HYNIC)为螯合剂,采用间接标记法,三羟甲基甘氨酸(tricine)与乙二胺二乙酸(EDDA)作为协同配体,99mTc标记后经Sep-PakC18反相层析柱进行纯化后,并对其标记率、放化纯、稳定性进行研究。(2)正常小鼠体内生物学分布研究:正常昆明小鼠25只,随机分为5组,分别于尾静脉注射99mTc-HYNIC-Tat49-57-DEVD,每只动物注入标记物7.4MBq,注射后15min、30min、60min、180min、300min处死,取感兴趣器官称重并测量放射性计数,经时间衰减校正后计算每克组织的百分注射量(%ID/g)。2.在肿瘤细胞凋亡模型中细胞摄取的体外研究:将标记物与经过环磷酰胺诱导凋亡的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞进行体外细胞摄取实验和竞争抑制实验,得到标记物与MCF-7细胞凋亡模型的在不同时间点的细胞摄取动力学研究,并比较其与正常细胞及不同凋亡水平下细胞模型的细胞摄取有无差异性进行研究。同时对诱导凋亡的肿瘤细胞行免疫组织化学研究,检测Caspase-3酶的表达情况。3.体内凋亡显像和竞争抑制SPECT显像的研究:(1)荷乳腺癌裸鼠显像研究:荷人乳腺癌裸鼠在经制模(经荷瘤裸鼠腹腔内注射溶于1ml PBS磷酸盐缓冲液(PH=7.3)的环磷酰胺(药物剂量按体重150mg/kg))化疗72小时后注射示踪剂后30min、60min、90min、120min、180min、360min进行全身平面显像,图像处理采用感兴趣区(ROI)技术,计算不同时相肿瘤与对侧肢体相应部位的放射性比值。(2)荷乳腺癌裸鼠体内分布研究:取5只荷瘤裸鼠于注射示踪剂90min后处死,取对侧肢体相应部位及肿瘤组织称重并测量放射性计数,计算二者的摄取比值。(3)肿瘤组织切片免疫组织化学研究:采用免疫组织化学染色SP法(链霉卵白素-过氧化物酶法技术),检测Caspase-3酶的表达情况。结果1..99mTc-HYNIC-Tat49-57-DEVD标记条件的研究:①采用tricine/EDDA作为协同配体,99mTc-HYNIC-Tat49-57-DEVD放化纯91%。与新鲜人血清孵育30mmin和120min后,放射化学纯度分别为91.5%和90.8%;经Sep-Pak C18反相层析柱分析,其间放射性峰均未见漂移。于室温下放置5h,其放射化学纯度为90%。②标记物在正常昆明小鼠体内生物学分布实验显示,99mTc-HYNIC-Tat49-57-DEVD血液清除速度较快,主要以肝脏和肾脏排泄。2.标记肿瘤细胞凋亡模型中细胞摄取的体外研究在化疗药物环磷酰胺的诱导下,人乳腺癌细胞株MCF-7细胞标记物在肿瘤细胞体外凋亡模型中细胞摄取率与不同的细胞凋亡水平有相关性(r=0.856,P<0.01),且细胞摄取可被特异性的竞争抑制。药物诱导发生凋亡的MCF-7细胞Caspase-3呈阳性表达。3.标记物在荷瘤裸鼠模型的体内凋亡显像研究荷瘤小鼠注射显像剂后的SPECT显像在90min时可见肿瘤组织放射性浓聚明显异常,注射显像剂后肿瘤/肌肉放射性摄取比值T/B最高为2.23±0.13,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。体内生物分布实验示,注射显像剂后肿瘤/肌肉放射性摄取比值为3.29±0.82。环磷酰胺治疗对照组肿瘤组织切片免疫组化染色Caspase-3的表达主要见于肿瘤细胞胞浆中,呈棕色颗粒状或弥漫性分布,细胞核内少见。生理盐水治疗对照组的肿瘤细胞胞浆中,则没有见到明显染色。结论以HYNIC作为双功能螯合剂标记穿膜肽修饰的Caspase-3底物多肽Tat49-57-DEVD方法可行,步骤简便,标记率高,体外稳定性好,在体内主要以肝脏和肾脏排泄;体外细胞摄取较为理想,与细胞凋亡程度密切相关,而在正常昆明小鼠体内生物分布特征以及荷瘤裸鼠模型中体内凋亡显像研究均表明标记后的99mTc-HYNIC-Tat49-57-DEVD仍保持良好的生物学特性,是一种具有潜质的凋亡显像剂,为无创、动态、实时监测体内组织凋亡状态打下了基础,其临床应用有待进一步深入研究。

全文目录


前言  6-10
中文摘要  10-13
英文摘要  13-17
第一部分 新型分子探针的放射性核素标记及其在昆明小鼠体内分布的研究  17-32
  摘要  17-18
  Abstract  18-21
  材料与方法  21-25
  结果  25-29
  讨论  29-31
  结论  31-32
第二部分 新型分子探针在肿瘤细胞凋亡模型中细胞摄取的研究  32-45
  摘要  32-33
  Abstract  33-34
  材料与方法  34-39
  结果  39-43
  讨论  43-44
  结论  44-45
第三部分 新型分子探针在人乳腺癌荷瘤裸鼠模型中的SPECT凋亡显像研究  45-62
  摘要  45-46
  Abstract  46-48
  材料与方法  48-53
  结果  53-59
  讨论  59-61
  结论  61-62
全文总结  62-64
参考文献  64-70
综述  70-85
附录  85-87
  附录一 中英文对照表  85-86
  附录二 攻读博士学位期间撰写及发表的文章  86-87
致谢  87

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