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新发感染性疾病的未知病毒性病原体检测及鉴定技术的建立

作　者: 于庭
导　师: 马忠森
学　校: 吉林大学
专　业: 内科学
关键词: 改良的非序列依赖的单引物扩增技术新发感染病病毒性病原 HBV HIV EV71 DNA病毒 RNA病毒
分类号: R373
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究利用病毒仅具有“核酸—蛋白质复合体”大分子以及几乎所有医学病毒都具有耐受DNase处理的衣壳蛋白的特征,采用非序列依赖的单引物扩增方法,对DNA病毒经Klenow Fragment补平、RNA病毒反转录成cDNA后再合成双链cDNA,经四碱基限制性内切酶酶切,加接头分子,以此为模板、以接头分子为引物进行单引物PCR扩增；构建PCR产物克隆、测序,在GenBank上BLAST序列比对分析及核酸进化树分析,判断所检测病毒的种属。在此基础上将标本的预处理改在生物安全柜内进行,减少无关核酸的影响。同时,选定乙型肝炎病毒(DNA病毒)和艾滋病毒(RNA病毒)为研究对象,分别收集乙型肝炎和艾滋病病人各3例血清标本,验证上述检测新发未知病毒性感染疾病病原体技术的特异性和灵敏性。结果显示,DNaseⅠ处理血清中内源DNA未观察病毒DNA降解；非序列依赖的单引物扩增血清中病毒DNA核酸可得到多个DNA片段；将所有PCR产物克隆、测序,序列经GenBank BLAST软件比对分析显示,105GE/ml以上拷贝数的病毒被检出,与HBV DNA同源性达98%-100%。与HIV基因序列同源性达91%～97%；以引起手足口病的肠道病毒EV71验证所建立的病毒性病原体的检测技术,非序列依赖的单引物可以扩增粪便标本中病毒核酸得到多个DNA片段：将所有PCR产物克隆、测序,BLAST分析,所得序列中,有的序列与GenBank中登录的EV71基因序列同源性达98%-99%；有的序列与GenBank中登录的单核细胞增生李斯特(Listeria monocytogenes)菌CDC54007同源性达81%。上述研究结果证实,应用所建立的改良的非序列依赖的单引物扩增方法可以检测血清中105GE/ml以上拷贝数的DNA及RNA病毒性病原；上述检测技术不仅适用于血清标本,也适用于粪便标本的检测；检测技术不依赖于被检病毒的核酸序列等信息；可以检测已知病毒,也可以鉴定未知病毒；检测过程不依赖于病毒的分离培养,因此缩短了检测时间,可以快速检测和鉴定病毒性病原体。

全文目录

提要  4-9
前言  9-11
第1章文献综述  11-35
  1.1 新发感染病的流行趋势及危害  11-21
    1.1.1 新发感染病的特点  11-14
    1.1.2 新发感染病流行的影响因素  14-17
    1.1.3 新发感染病出现的机制  17-18
    1.1.4 新发感染病的危害  18-20
    1.1.5 我国新发感染病的流行现状  20-21
  1.2 病毒的变异和进化给新发病毒性感染病的诊治带来更大的困难  21-25
    1.2.1 病毒进化(virus evolution)的原因  21
    1.2.2 病毒突变与进化方式  21-24
    1.2.3 病毒突变为疾病的诊治带来新的问题  24-25
  1.3 病毒性病原诊断技术  25-35
    1.3.1 病毒性疾病诊断技术的发展  25-29
    1.3.2 病毒性疾病诊断发展的趋势  29-30
    1.3.3 发现新病毒的主要技术路线  30-35
第2章新发感染病DNA病毒性病原检测方法的建立  35-55
  2.1 材料和方法  35-41
    2.1.1 材料  35-36
    2.1.2 方法  36-41
  2.2 结果  41-52
    2.2.1 选取乙型肝炎患者标本,作为建立DNA病毒性病原体检测技术平台的研究对象  41
    2.2.2 DNase Ⅰ消化宿主核酸对病毒DNA浓度的影响  41-42
    2.2.3 非序列依赖单引物PCR扩增(SISPA)血清中微量病原DNA  42-43
    2.2.4 PCR产物克隆、测序  43-46
    2.2.5 序列分析  46-52
  2.3 讨论  52-55
第3章新发感染病RNA病毒性病原检测方法的建立  55-77
  3.1 材料和方法  55-63
    3.1.1 材料  55-56
    3.1.2 方法  56-63
  3.2 结果  63-74
    3.2.1 选取艾滋病患者标本,作为建立RNA病毒性病原体检测技术平台的研究对象  63-64
    3.2.2 非序列依赖单引物PCR方法扩增血清中微量病原RNA  64-65
    3.2.3 PCR产物克隆、测序  65-68
    3.2.4 序列分析  68-74
  3.3 讨论  74-77
第4章应用手足口病病原体的检测验证改良的SISPA方法  77-99
  4.1 材料和方法  77-84
    4.1.1 材料  77-78
    4.1.2 方法  78-84
  4.2 结果  84-97
    4.2.1 选取手足口病患者标本,验证所建立的RNA病毒性病原体检测技术-改良的SISPA方法  84-85
    4.2.2 应用改良的非序列依赖单引物PCR方法扩增标本中微量病原体RNA  85
    4.2.3 PCR产物克隆、测序  85-89
    4.2.4 序列分析  89-97
  4.3 讨论  97-99
本研究的主要创新点  99-101
参考文献  101-111
攻读博士学位期间已发表及待发表论文  111-113
致谢  113-115
中文摘要  115-119
Abstract  119-122

新发感染性疾病的未知病毒性病原体检测及鉴定技术的建立

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