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氧化葡萄糖酸杆菌高密度培养及生物催化合成羟基酸的研究

作　者: 魏国栋
导　师: 魏东芝
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 氧化葡萄糖酸杆菌 高密度培养 全细胞催化 原位分离 羟基酸
分类号: TQ921.7
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


羟基酸可作为许多生物起源化合物的双功能构建模块,是重要的医药、农药和精细化工产品的中间体。开展生物催化醇类化合物制备羟基酸的研究具有重要的理论价值和现实意义。氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)具有大量的膜结合脱氢酶,能够不完全氧化多种糖、醇化合物生成相应的醛、酮和酸。本论文以两种羟基酸(羟基乙酸和β-羟基异丁酸)的生物合成为研究对象,详细探讨了氧化葡萄糖酸杆菌的培养、全细胞催化过程以及产物的分离等方面内容。第一,以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003为出发菌株,对它的高密度培养进行了较为系统的研究,目的是为了获得大量的细胞催化剂和高效的催化效率。(1)首先采用单因素法和均匀设计法对氧化葡萄糖酸杆菌的培养基组分进行优化,确定发酵培养基的最佳配方：山梨醇73.0g/l,酵母粉18.4g/l,硫酸铵1.5g/l,磷酸二氢钾1.52g/l,七水硫酸镁0.47g/l,并初步确定了氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003菌株培养的最适培养条件。在最适条件下,菌体密度为9.6g/l。(2)在摇瓶实验的基础上,进行3.7L发酵罐放大培养,菌体密度达到44.3g/l,比摇瓶的培养结果提高了361%。采取合适的补料策略,菌体的密度进一步提高到54.2g/l(干重14.1g/l),高于目前文献报道的最好结果13.5g/l(干重),同时细胞的相对催化活性也提高了40%。高密度、高活性细胞的获得,为羟基酸的生物法合成奠定了基础。第二,以氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化乙二醇合成羟基乙酸为模式反应,揭示催化反应的关键酶,详细研究生物催化合成羟基酸的过程。(1)通过基因敲除和互补以及全细胞催化实验,鉴定了氧化葡萄糖酸杆菌中催化乙二醇的关键酶——膜结合的乙醇脱氢酶(GOX1067-1068)。(2)确定了氧化葡萄糖酸杆菌在摇瓶中转化乙二醇的最优反应条件,并在摇瓶实验的基础上在3.7L生物反应器中进行转化过程的放大,通过流加底物,提高溶氧水平和在线调节pH等优化手段,经过50h的反应,羟基乙酸的浓度达到74.5g/l,转化率达到87.1%。产物抑制效应是限制反应产率的关键问题。(3)针对乙二醇反应过程中存在的产物抑制问题,引入原位分离技术,进行乙二醇的催化过程研究。①选择D315树脂作为原位分离的介质。为了截留细胞,选用聚乙烯醇-海藻酸钠对细胞进行固定化。经过72h的原位分离转化,羟基乙酸的浓度达到90.2g/l,转化率为80.3%。②鉴于固定化细胞催化活性较低、在剪切力下容易破碎的问题,引入中空纤维膜模块,实现游离细胞的循环利用。经过50h的原位分离转化,羟基乙酸浓度达到93.2g/l,转化率为81%。相比于常规的分批转化结果,采用膜反应器原位分离技术后,羟基乙酸的最终浓度从74.5g/l提高到了93.2g/l,转化效率也从1.5g/(1·h)提高到了1.9g/(1·h)。开展氧化葡萄糖酸杆菌催化乙二醇合成羟基乙酸的研究,对于氧化葡萄糖酸杆菌的开发应用和羟基乙酸的生物法制备都具有十分重要的意义。(4)根据催化体系的特点及转化液的组成,详细地给出了羟基乙酸分离提纯的流程。经过活性炭进行脱色、D315阴离子树脂和D113阳离子树脂纯化、浓缩结晶等步骤,过程总收率85%,羟基乙酸晶体的纯度为97.3%。第三,对氧化葡萄糖酸杆菌立体选择催化2-甲基-1,3-丙二醇生成(R)-β-羟基异丁酸进行研究。(1)首先对2-甲基-1,3-丙二醇的转化产物进行了分离纯化和鉴定,产物是(R)-β-羟基异丁酸,副产物为2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸。通过基因敲除、互补和静息细胞催化实验,确定了膜结合的乙醇脱氢酶是催化2-甲基-1,3-丙二醇生成(R)-β-羟基异丁酸反应的关键酶。(2)确定了氧化葡萄糖酸杆菌在摇瓶中催化2-甲基-1,3-丙二醇生成(R)-β-羟基异丁酸的最优反应条件,并在摇瓶实验的基础上在3.7L生物反应器中进行放大,经过24h的反应,(R)-β-羟基异丁酸的积累浓度达到50.2g/l,转化率和光学纯度分别达到90.5%和93.2%。这为生物法合成(R)-β-羟基异丁酸提供了新的选择,具有进一步开发前景。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-16
第一章 前言  16-36
  1.1 高密度培养技术  16-17
  1.2 生物催化与生物转化  17-19
  1.3 手性技术  19-20
    1.3.1 手性技术与手性产品  19
    1.3.2 手性化合物的制备方法  19-20
      1.3.2.1 手性源  19-20
      1.3.2.2 消旋体拆分  20
      1.3.2.3 不对称合成  20
  1.4 氧化葡萄糖酸杆菌的特性  20-21
  1.5 氧化葡萄糖酸杆菌的基因组特征与脱氢酶  21-23
  1.6 氧化葡萄糖酸杆菌的应用于开发  23-27
    1.6.1 维生素C的生产  24
    1.6.2 合成米格列醇  24-25
    1.6.3 合成葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸  25-26
    1.6.4 合成二羟基丙酮  26-27
  1.7 氧化葡萄糖酸杆菌在手性催化方面的应用  27-28
  1.8 羟基乙酸的性质和应用及生产工艺  28-30
    1.8.1 羟基乙酸的性质及应用  28-29
    1.8.2 羟基乙酸的制备方法  29-30
      1.8.2.1 化学法  29
      1.8.2.2 生物法  29-30
  1.9 β-羟基异丁酸的应用和生产工艺  30-34
    1.9.1 β-羟基异丁酸的应用  30-34
    1.9.2 β-羟基异丁酸的制备方法  34
      1.9.2.1 化学法  34
      1.9.2.2 生物法  34
  1.10 本研究论文选题的依据和意义以及主要研究内容  34-36
第二章 氧化葡萄糖酸杆菌的高密度培养  36-53
  2.1 引言  36
  2.2 材料与方法  36-40
    2.2.1 实验材料  36-37
      2.2.1.1 菌种  36
      2.2.1.2 试剂  36-37
      2.2.1.3 实验仪器  37
    2.2.2 实验方法  37
      2.2.2.1 菌种活化  37
      2.2.2.2 菌体摇瓶培养  37
      2.2.2.3 菌体发酵罐培养  37
    2.2.3 分析方法  37-40
      2.2.3.1 菌体浓度测定  37-38
      2.2.3.2 乙二醇的测定  38
      2.2.3.3 乙二醇标准曲线制作  38-39
      2.2.3.4 羟基乙酸的测定  39
      2.2.3.5 羟基乙酸标准曲线  39-40
      2.2.3.6 细胞催化活性的测定  40
  2.3 结果与讨论  40-52
    2.3.1 不同保藏菌株性能考察  40
    2.3.2 培养基优化  40-44
      2.3.2.1 碳源的选择  40-41
      2.3.2.2 氮源的选择  41-42
      2.3.2.3 无机盐的选择  42
      2.3.2.4 均匀设计实验  42-44
      2.3.2.5 模型的验证  44
    2.3.3 菌体培养条件的优化  44-48
      2.3.3.1 培养温度对菌体生长和细胞催化活性的影响  44
      2.3.3.2 pH对菌体生长和细胞催化活性的影响  44-46
      2.3.3.3 溶氧对菌体生长和细胞催化活性的影响  46-47
      2.3.3.4 培养时间对菌体生长和细胞催化活性的影响  47-48
    2.3.4 发酵罐放大培养  48-51
      2.3.4.1 分批发酵  48-49
      2.3.4.2 补料分批发酵  49-51
    2.3.5 优化前后细胞催化活性的比较  51-52
  2.4 本章小结  52-53
第三章 氧化葡萄糖酸杆菌催化乙二醇生成羟基酸的研究  53-68
  3.1 引言  53
  3.2 材料与方法  53-55
    3.2.1 实验材料  53-54
      3.2.1.1 菌种  53-54
      3.2.1.2 试剂  54
      3.2.1.3 实验仪器  54
    3.2.2 实验方法  54
      3.2.2.1 菌体的培养  54
      3.2.2.2 乙二醇转化反应  54
    3.2.3 分析方法  54-55
      3.2.3.1 乙二醇的测定  54
      3.2.3.2 羟基乙酸的测定  54-55
  3.3 结果与讨论  55-67
    3.3.1 乙二醇催化反应关键酶的确定  55-56
    3.3.2 静息细胞催化乙二醇生成羟基乙酸的反应过程研究  56-64
      3.3.2.1 反应温度对催化乙二醇反应的影响  56
      3.3.2.2 溶氧对催化乙二醇反应的影响  56-59
        3.3.2.2.1 摇床转速对催化乙二醇反应的影响  56-57
        3.3.2.2.2 添加氧载体对催化乙二醇反应的影响  57-59
      3.3.2.3 pH对乙二醇转化的影响  59
      3.3.2.4 细胞浓度对催化乙二醇反应的影响  59-60
      3.3.2.5 底物浓度对催化乙二醇反应的影响  60-61
      3.3.2.6 羟基乙酸浓度对催化乙二醇反应的影响 #46.  61
      3.3.2.7 添加不同金属离子对乙二醇转化的影响  61-62
      3.3.2.8 菌体培养阶段添加醇类物质对菌体转化能力的影响  62-63
      3.3.2.9 细胞的重复使用  63-64
    3.3.3 3.7L生物反应器放大研究  64-67
      3.3.3.1 不同细胞浓度下转化乙二醇生成羟基乙酸  64-65
      3.3.3.2 用流加方式转化乙二醇  65-67
  3.4 本章小结  67-68
第四章 生物反应分离耦合技术制备羟基乙酸  68-82
  4.1 引言  68
  4.2 材料与方法  68-72
    4.2.1 实验材料  68-69
      4.2.1.1 菌种  68-69
      4.2.1.2 试剂  69
      4.2.1.3 实验仪器  69
    4.2.2 实验方法  69-72
      4.2.2.1 分离介质的筛选  69
      4.2.2.2 树脂的预处理  69-70
      4.2.2.3 树脂的性能研究  70
      4.2.2.4 细胞的固定化  70-71
      4.2.2.5 原位分离  71-72
  4.3 结果与讨论  72-81
    4.3.1 分离介质的筛选及性能考察  72-77
      4.3.1.1 离子交换树脂的筛选  72-73
      4.3.1.2 D315树脂静态吸附羟基乙酸的平衡时间  73-74
      4.3.1.3 pH值对树脂D315吸附羟基乙酸的影响  74-75
      4.3.1.4 温度对D315树脂吸附羟基乙酸的影响  75-76
      4.3.1.5 溶液中乙二醇浓度对D315树脂吸附羟基乙酸的影响  76
      4.3.1.6 D315树脂对乙二醇的吸附能力  76-77
    4.3.2 洗脱系统的研究  77
    4.3.3 反应分离耦合工艺的研究  77-81
      4.3.3.1 固定化细胞原位分离转化乙二醇生成羟基乙酸工艺的研究  78-80
        4.3.3.1.1 固定化细胞和游离细胞活性的比较  78
        4.3.3.1.2 固定化细胞催化稳定性  78-79
        4.3.3.1.3 原位分离体系中固定化细胞转化乙二醇的过程  79-80
      4.3.3.2 中空纤维膜反应器原位分离转化乙二醇生成羟基乙酸工艺的研究  80-81
  4.4 本章小结  81-82
第五章 羟基乙酸的分离纯化  82-87
  5.1 引言  82
  5.2 材料和方法  82-83
    5.2.1 主要仪器和材料  82
    5.2.2 实验方法  82-83
      5.2.2.1 羟基乙酸转化液  82-83
      5.2.2.2 脱色  83
      5.2.2.3 离子交换树脂的处理  83
      5.2.2.4 离子交换树脂纯化羟基乙酸  83
      5.2.2.5 结晶  83
    5.2.3 分析方法  83
      5.2.3.1 乙二醇和羟基乙酸的测定  83
      5.2.3.2 脱色率的测定  83
    5.2.4 具体步骤  83
  5.3 结果与讨论  83-86
    5.3.1 羟基乙酸转化液脱色  83-85
      5.3.1.1 活性炭用量对脱色的影响  83-85
      5.3.1.2 时间对活性炭吸附及脱色的影响  85
    5.3.2 阴离子交换  85
    5.3.3 阳离子交换  85
    5.3.4 羟基乙酸结晶的研究  85-86
  5.4 本章小结  86-87
第六章 氧化葡萄糖酸杆菌立体选择催化2-甲基-1,3-丙二醇合成(R)-β-羟基异丁酸  87-103
  6.1 引言  87
  6.2 材料与方法  87-91
    6.2.1 实验材料  87-88
      6.2.1.1 菌种  87-88
      6.2.1.2 试剂  88
      6.2.1.3 实验仪器  88
    6.2.2 实验方法  88
      6.2.2.1 菌体培养  88
      6.2.2.2 2-甲基-1,3-丙二醇转化反应  88
    6.2.3 分析方法  88-91
      6.2.3.1 2-甲基-1,3-丙二醇测定方法的确定  88-89
      6.2.3.2 2-甲基-1,3-丙二醇标准曲线制作  89
      6.2.3.3 β-羟基异丁酸测定方法的确定  89-90
      6.2.3.4 β-羟基异丁酸标准曲线的制作  90
      6.2.3.5 β-羟基异丁酸对映体过量值测定条件的确定  90-91
      6.2.3.6 光学纯度的计算  91
    6.2.4 产物的分离纯化  91
  6.3 结果与讨论  91-102
    6.3.1 氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞催化2-甲基-1,3-丙二醇生成的产物鉴定  91-96
      6.3.1.1 氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞催化2-甲基-1,3-丙二醇时的产物生成情况  91-93
      6.3.1.2 产物的分离纯化  93-94
      6.3.1.3 产物的鉴定  94-95
      6.3.1.4 产物β-羟基异丁酸的精制  95-96
    6.3.2 氧化葡萄糖酸杆菌中负责催化2-甲基-1,3-丙二醇的关键酶的确定  96-97
    6.3.3 静息细胞转化2-甲基-1,3-丙二醇生成(R)-β-羟基异丁酸的反应过程研究  97-101
      6.3.3.1 底物浓度对产物生成和选择性的影响  97-98
      6.3.3.2 细胞浓度对反应的影响  98-99
      6.3.3.3 pH对2-甲基-1,3-丙二醇转化反应的影响  99-100
      6.3.3.4 温度对2-甲基-1,3-丙二醇转化的影响  100
      6.3.3.5 在培养基中添加诱导物对反应的影响  100-101
    6.3.4 3.7L生物反应器放大反应  101-102
  6.4 本章小结  102-103
第7章 结论与展望  103-106
  7.1 结论  103-104
  7.2 展望  104-106
参考文献  106-115
博士期间论文发表情况  115-116
致谢  116-118

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