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尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究

作　者: 耿丽
导　师: 何深一
学　校: 山东大学
专　业: 病原生物学
关键词: 尿路致病性大肠埃希菌 Ⅰ型菌毛 fimH基因免疫效果
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：尿路感染(Urinary tract infection, UTI)是一种常见的临床疾病,引起UTI的致病菌约70%～95%为尿路致病性大肠埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPE)。UPEC的临床分离株对抗菌药物多表现为多重耐药,给其感染的治疗带来一定困难,故研制疫苗用以预防UPEC感染具有重要的现实意义。本实验构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛 fimH基因真核表达载体,并研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗产生的免疫反应及对小鼠的免疫保护作用,同时对本疫苗经不同免疫途径产生的免疫效果进行初步比较。方法：1.提取尿路致病性大肠埃希菌临床株基因组DNA, PCR扩增fimH基因片段,然后克隆到TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将f imH基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-f imH重组质粒。通过PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-f imH进行鉴定。2.大量扩增并纯化质粒pcDNA3.0-f imH以免疫BABL/c小鼠。选取BALB/c小鼠40只,随机分为四组(PBS组、空质粒组、pcDNA3.0-fimH肌肉注射组、pcDNA3.0-fimH滴鼻组),使用本室构建的fimH基因的真核表达载体pcDNA3.0重组质粒分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)2种途径免疫BALB/c小鼠,同时分别以载体质粒(pcDNA3.0)和PBS液为空质粒对照和空白对照,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,四组共连续免疫3次,检测小鼠血清中特异的IgG抗体。于末次免疫后第10天,以UPEC分离株菌液进行尿道上行攻击；攻击后第5天对小鼠及尿液进行细菌培养和计数(每只小鼠取尿液10μl接种于麦康凯平板。37℃培养24小时,第二天观察细菌菌落,进行菌落计数)。结果：1. pcDNA3.0-f imH重组质粒经PCR扩增获得了约910bp的片段；pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamH I和XhoⅠ双酶切后,产生了1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-f imH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中；测序获得的fimH DNA序列与GenBank登录的J 96株fimH DNA的编码序列基本一致。表明成功构建了尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH;。2.将质粒免疫小鼠可诱导小鼠产生抗Ⅰ型菌毛抗体。免疫小鼠后,肌注组与滴鼻组小鼠血清特异性[gG抗体均明显升高,高于对照组及空质粒组(P<0.05)；3. UPEC分离株菌液攻击小鼠后,进行小鼠尿液菌落计数,pcDNA3.0-fimH肌注组与滴鼻组小鼠尿液菌落计数明显少于对照组及空质粒组(P<0.05)。结论：1.成功构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3. O-fimH;2.动物实验结果表明,pcDNA3.0-fimH作为基因疫苗,可诱导BALB/c小鼠产生特异的体液免疫,对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用；不同的免疫途径免疫效果亦有不同。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
符号说明  11-12
前言  12-14
第一部分  14-45
  材料与方法  14-34
  结果  34-42
  讨论  42-45
第二部分  45-56
  材料与方法  45-51
  结果  51-53
  讨论  53-56
结论  56-57
附录  57-59
参考文献  59-63
综述  63-69
  参考文献  67-69
致谢  69-70
攻读学位期间发表的学术论文  70-71
学位论文评阅及答辩情况表  71

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究

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