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HRE启动子调控分泌表达PR39重组AAV的构建及在CHD基因治疗中的应用研究

作　者: 聂小维
导　师: 孙立军
学　校: 第四军医大学
专　业: 影像医学与核医学
关键词: 低氧反应元件HRE 低氧诱导基因治疗心肌梗死
分类号: R541.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的为了探讨HRE启动子控制下分泌表达PR39重组AAV对缺血性心脏病基因治疗，本实验首先人工合成微小HRE，构建T-HRE-CMV-PolyA载体，再将NT4-TAT-His-PR39装入HRE调节的腺相关病毒载体，验证其在人脐静脉内皮细胞（CRL-1730细胞株）表达、及其在猪AMI后对心肌细胞促血管生成作用。方法1﹑设计微小HRE/CMV，应用PCR技术人工合成和T载体克隆法克隆，酶切鉴定后进行DNA测序及分析。2﹑将编码HRE/CMV、NT4-6His-PR39的基因片段用T4DNA连接酶连接，构建成质粒pSS-HRE-CMVNT4-6His-PR39-PolyA-AAV。3﹑采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞，包装成重组病毒，并应用斑点杂交试验测定其滴度。4﹑等体积pSS-HRE-CMV- NT4-6His-PR39-PolyA-AAV和空病毒（EV）分别感染人脐静脉内皮细胞（CRL-1730细胞株），免疫细胞化学测定6×His在CRL-1730内表达情况，验证PR39的表达情况。5﹑18只小型猪建立AMI模型后随机分为实验组1（HRE-AAV-PR39组）、对照组1（生理盐水组）、对照组2（空病毒组），应用MR电影技术和心肌灌注MR成像，来评估缺血区的范围。定期处死猪后，获取缺血区心肌标本，收集形态学、病理学数据。结果1﹑根据文献和数据库资料，设计迄今最小HRE序列，经PCR技术成功合成，并插入到pGEM-Teasy质粒中进行克隆，送DNA测序检测，其结果与设计的序列一致。2﹑单酶切法获得大量的HRE，再连入改造后的pSSHGAAV（pSSV9int-/Xba I）载体，再经EcoR I和BamH I双酶切后插入已合成的NT4-6His-PR39基因片段，两次反应均经酶切鉴定正确，说明重组质粒pSS-HRE-CMV- NT4-6His-PR39-PolyA-AAV构建成功。3﹑采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染包装细胞，并应用斑点杂交试验测定其滴度大小为3.4×10~9 p.f.u。4﹑免疫细胞化学测定CRL-1730中HRE调控下NT4-TAT-His-PR39中的6×His表达，实验组阳性表达有统计学意义。5﹑心肌MR灌注成像显示梗死心肌面积在pSS-HRE-CMV-NT4-PR39-PolyA-AAV作用下明显减小，有统计学意义。结论1﹑使用PCR方法可以将人工合成的HER插入缺乏内切酶识别点的CMV启动子上游，并制备低氧调控的真核表达载体。2﹑成功构建pSS-HRE-CMV-NT4-TAT-6His-PR39-PolyA-AAV，并包装成较高浓度的病毒。3﹑免疫细胞化学测定CRL-1730中人工合成的微小HRE能够有效的调控CMV启动子控制的下游基因NT4-TAT-His-PR39表达。4﹑MR电影技术和心肌灌注MR成像可有效定量评价AMI的范围和心肌血流灌注。5﹑重组pSS-HRE-CMV-NT4-PR39-PolyA-AAV可以促进心肌缺血区新血管生成，有效减小心肌梗死区面积，改善心功能。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-15
文献回顾  15-25
  一、PR39用于IHD基因治疗的作用及研究进展  15-18
  二、启动子在IHD基因治疗中的作用及研究进展  18-22
  三、腺相关病毒  22-25
实验一融合基因HRE-CMV-MCS-PolyA 的合成和克隆  25-33
  1 材料  25-26
  2 方法  26-30
  3 结果  30-31
  4 讨论  31-33
实验二原核表达载体的构建  33-40
  1 材料  33
  2 方法  33-38
  3 结果  38
  4 讨论  38-40
实验三重组病毒的包装  40-44
  1 材料  40
  2 方法  40-43
  3 结果  43
  4 讨论  43-44
实验四免疫细胞化学测定CRL-1730中HRE调控下NT4-TAT-His-PR39的表达  44-48
  1 材料  44
  2 方法  44-46
  3 结果  46
  4 讨论  46-48
实验五 HRE 启动子调控PR39的重组AAV对缺血性猪心肌的治疗研究  48-53
  1 材料  48
  2 方法  48-50
  3 结果  50-51
  4 讨论  51-53
小结  53-54
参考文献  54-62
附录  62-69
个人简历和研究成果  69-70
致谢  70

HRE启动子调控分泌表达PR39重组AAV的构建及在CHD基因治疗中的应用研究

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