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草茎点霉作为生物除草剂防除鸭跖草的潜力及环境生物安全评价

作　者: 谷祖敏
导　师: 纪明山
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 有害生物与环境安全
关键词: 真菌除草剂 鸭跖草 草茎点霉 致病力 真菌毒素
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


本文以大田中发生严重的鸭跖草为靶标,从辽宁省不同地区鸭跖草叶片上分离筛选出对鸭跖草致病力强,对大多数作物安全的草茎点霉SYAU-06菌株。通过对SYAU-06活体菌株的寄主范围、生物学特性、侵染过程、侵染影响因子和毒素的除草活性、提取工艺、作用机理、生物安全性、分离提纯技术研究以及结构解析,从活体菌株和毒素两个方面系统评价了SYAU-06菌株防除鸭跖草的潜力,为鸭跖草的生物防治提供新的方法和思路。1.对鸭跖草病原真菌进行了筛选。从辽宁省不同地区采集的鸭跖草叶片上共分离到7种植物病原真菌,通过形态鉴定分别为草茎点霉（Phoma herbarum）,新月弯孢（Curvularia lunata）,平脐蠕孢属（Bipolaris sp.）,突脐蠕孢（Exserohilum sp.）,交链孢菌（Alternaria alternata）,胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和灰梨孢霉（pyricularia grisea）。分离到的7种植物病原真菌经致病力和安全性测定显示,草茎点霉对鸭跖草的致病力最强,病叶率和病情指数分别为95.67%和76.42,对大多数作物安全,仅对玉米幼苗造成轻微伤害,而不影响其生长发育;新月弯孢、平脐蠕孢、突脐蠕孢、胶孢炭疽菌、梨孢霉对鸭跖草的致病力较低,病叶率低于50%,病情指数小于20;交链格孢菌接种鸭跖草后病叶率60%,病情指数21.14,但中度侵染水稻和玉米。通过测定菌株28SrDNA序列并进行序列比对,有4个草茎点霉菌（P.herbarum）序列与01菌株的相似性达98%以上,从分子水平进一步证实01菌株为草茎点霉。通过单孢分离从不同地区的鸭跖草叶片上共获得11株草茎点霉,比较了不同分离菌株在培养特征、致病性、产毒能力方面的差异并运用RAPD方法分析了不同菌株的遗传差异。从本溪地区分离的SYAU-06菌株在生长速度、产孢量和产毒能力等方面均具有显著优势。SYAU-06菌株寄主范围测试表明在供试的7科18种大田作物和蔬菜中仅玉米和高粱叶片有轻微的伤害反应,在供试的14科27种杂草中,对鸭跖草高度敏感,对苋科的反枝苋、凹头苋和藜科的藜轻度敏感。从致病力和安全性的角度考虑选择草茎点霉SYAU-06菌株作为生物除草剂的候选菌,评价其对鸭跖草的除草潜力。2.系统研究了草茎点霉SYAU-06菌株生物学特性和与农药的相容性。最适合草茎点霉SYAU-06菌株菌丝生长的培养基为鸭跖草汁+葡萄糖培养基;最适合的碳源为乳糖和葡萄糖,氮源为酵母膏;最适温度为25-30℃,最适pH为8。最适合草茎点霉SYAU-06菌株形成分生孢子器的培养基为玉米粉培养基;最适温度为25-30℃,最适pH为7-8,而且光照有利于产孢,适量的紫外线照射可诱导分生孢子器的形成。分生孢子萌发最适温度为25-30℃,最适pH为7,加入营养物质如葡萄糖、蔗糖可促进分生孢子萌发。采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了草茎点霉SYAU-06菌株与12种农田常用化学农药的相容性。结果表明杀虫剂与SYAU-06菌株的相容性最好,杀菌剂与SYAU-06菌株完全不相容,除草剂与SYAU-06菌株的相容性介于杀虫剂和杀菌剂之间。3.明确了草茎点霉SYAU-06菌株的侵染过程。通过显微和超微观察发现草茎点霉菌丝体接种2h细胞分裂尚未开始,接种6h菌丝顶端出现分枝,接种8h形成附着胞,接种12h通过表皮细胞中间、细胞间隙和气孔侵入叶片,接种24h叶片表皮细胞下可见到大量菌丝。4.以病叶率、病情指数和鲜重抑制率3项指标为原则,从生防真菌自身的生物学特性、杂草的发育阶段和环境条件三个方面研究SYAU-06菌株侵染鸭跖草发病的影响因子。在相同接种浓度下菌丝体对鸭跖草的侵染力最强,发病时间最早,其次是分生孢子,侵染力最弱的接种物是厚垣孢子。利用草茎点霉SYAU-06菌株成功控制鸭跖草危害,菌丝体的接种浓度要高于107mf·mL-1,培养时间控制在7-9d,寄主植物鸭跖草处于3叶期前。病害发生的最适温度范围是28-32℃,环境湿度保持在80%以上,接种后保湿时间至少需要48h,加入吐温-80和葡萄糖明显提高了生防菌的致病作用。保湿期的光照情况影响病害发生程度,光照时间越短,病害发生越严重。5.以种子萌发、胚根和胚芽伸长、植株生长量、叶片伤害反应为测定参数,明确了草茎点霉粗毒素的除草活性。在最高毒素浓度500μg·mL-1时,种子萌发的抑制率为17.89%,胚根和胚芽伸长的抑制率分别为37.26%和28.37%,植株鲜重减少了15.5%,叶片病斑面积6.53mm2。粗毒素杀草谱和对作物安全性测试结果为鸭跖草和藜对毒素最敏感,伤害反应为4级,反枝苋和虎尾草伤害反应分别为3级和1级;玉米和高粱对粗毒素敏感,小麦、大豆和花生不敏感。6.系统研究草茎点霉毒素的提取方法、提取条件和毒素的稳定性。明确草茎点霉SYAU-06菌株产生的毒素既有胞外毒素,又有胞内毒素,且用极性中等的乙酸乙酯萃取效果最好。大豆培养基和PSK分别是适合菌株生长和毒素分泌的固体培养基和液体培养基。确定有利于菌株产毒的温度为32℃、培养时间为14d、培养方式为150r·min-1振荡培养。毒素稳定性测试结果为贮存时间和光照对毒素活性没有影响,但毒素对温度比较敏感。7.阐明了草茎点霉毒素的作用机理。测定了草茎点霉毒素对鸭跖草叶片组织细胞膜透性和丙二醛（MDA）含量影响,发现毒素处理后叶片组织细胞膜透性上升,Na+和K+的渗漏量显著高于对照;膜脂过氧化加强,MDA含量增加;经毒素处理后叶片叶绿素含量下降,呼吸作用出现异常;草点霉毒素还抑制鸭跖草叶片组织中与植物抗性有关的CAT、POD、APX的活性。8.评价了草茎点霉毒素对环境生物的安全性。测定了草茎点霉毒素对柞蚕的触杀毒性LC50为58775.07 mg·L-1,胃毒毒性LD50为2359.78μg·g-1,表现为低毒;对蜜蜂、赤眼蜂、蚯蚓表现安全;12h对水蚤和96h对小球藻的毒性LC50分别为3771.97 mg.L-1和14214.68 mg·L-1,表现低毒;对土壤真菌、细菌和放线菌的数量没有影响。9.进行了草茎点霉毒素分离提纯技术的研究,初步明确了毒素纯品的结构。通过254nm、365nm紫外光显色和碘熏蒸显色筛选出毒素TLC适合的展开剂为正己烷:乙酸乙酯:甲酸的比例为（5:1:0.1）和（10:1:0.1）。利用二次硅胶柱层析和一次氧化铝柱层析得到草茎点霉毒素纯品,通过液相色谱检测纯度为97.89%。毒素组分在235nm处有最强的紫外吸收,质谱图中m/z为237.7的峰强度稳定,推测其分子量是238。红外光谱显示毒素存在-OH、-CH3、-COOH、-NO2的伸缩振动,并且存在苯环邻位取代的特征,推测除草活性组分含有邻硝基苯酸结构。

全文目录


摘要  12-15
英文摘要  15-18
前言  18-20
第一章 利用植物病原真菌防除杂草的研究进展(文献综述)  20-40
第二章 鸭跖草病原真菌的分原真菌防除杂离和筛选  40-68
  第一节 鸭跖草病原真菌的分离和致病力的比较研究  40-52
    1 材料与方法  40-42
    2 结果与分析  42-51
      2.1 鸭跖草病原真菌的分离与鉴定  42-50
      2.2 鸭跖草不同病原真菌对鸭跖草致病力的比较  50-51
      2.3 鸭跖草不同病原真菌对主要作物的安全性  51
    3 小结  51-52
  第二节 草茎点霉不同菌株培养特征和致病性及遗传差异性研究  52-63
    1 材料与方法  52-55
    2 结果与分析  55-62
      2.1 草茎点霉不同菌株的分离结果  55-56
      2.2 11个草茎点霉菌株形态特征的比较  56-58
      2.3 11个草茎点霉菌株菌落生长速率和产孢量的比较  58
      2.4 11个草茎点霉菌株致病力的比较  58-59
      2.5 11个草茎点霉菌株产毒能力的比较  59-60
      2.6 11个草茎点霉菌株基因组DNA纯度和分子量的检测  60-61
      2.7 11个草茎点霉菌株RAPD分析  61-62
    3 小结  62-63
  第三节 草茎点霉SYAU-06菌株寄主范围的测试  63-68
    1 材料与方法  64-65
    2 结果与分析  65-67
    3 小结  67-68
第三章 草茎点霉SYAU-06菌株生物学特性和与农药相容性研究  68-86
  第一节 草茎点霉SYAU-06菌株生物学特性研究  68-81
    1 材料与方法  68-71
    2 结果与分析  71-80
      2.1 草茎点霉SYAU-06菌株菌丝生长的影响因子  71-75
      2.2 草茎点霉SYAU-06菌株的产孢条件  75-78
      2.3 草茎点霉SYAU-06菌株分生孢子萌发的影响因素  78-80
    3 小结  80-81
  第二节 草茎点霉SYAU-06菌株与常用农药的相容性  81-86
    1 材料与方法  81-83
    2 结果与分析  83-85
      2.1 常用农药与草茎点霉菌丝的生物学相容性  83-84
      2.2 常用农药与草茎点霉分生孢子的生物学相容性  84-85
    3 小结  85-86
第四章 草茎点霉SYAU-06菌株侵染过程研究  86-91
  1 材料与方法  86-87
  2 结果与分析  87-90
    2.1 草茎点霉SYAU-06菌株侵入过程的显微观察  87-88
    2.2 草茎点霉SYAU-06菌株侵入过程的超微观察  88-90
  3 本章小结  90-91
第五章 草茎点霉SYAU-06菌株侵染鸭跖草影响因子研究  91-102
  1 材料与方法  91-94
  2 结果与分析  94-100
    2.1 草茎点霉SYAU-06菌株不同接种体类型对鸭跖草的侵染力  94-95
    2.2 菌丝体浓度对草茎点霉SYAU-06菌株侵染鸭跖草致病的影响  95
    2.3 菌丝体培养时间对草茎点霉SYAU-06菌株侵染鸭跖草致病的影响  95-96
    2.4 草茎点霉SYAU-06菌株对不同叶龄鸭跖草的致病力  96-97
    2.5 环境因素对草茎点霉SYAU-06菌株引致鸭跖草发病的影响  97-100
    2.6 介质对草茎点霉SYAU-06菌株引致鸭跖草发病的影响  100
  3 本章小结  100-102
第六章 草茎点霉粗毒素的除草活性和提取工艺研究  102-119
  第一节 草茎点霉粗毒素的除草活性和杀草谱研究  102-109
    1 材料与方法  102-104
    2 结果与分析  104-108
      2.1 草茎点霉粗毒素对鸭跖草种子萌发的抑制作用  104-105
      2.2 草茎点霉粗毒素对鸭跖草胚根和芽生长的抑制作用  105
      2.3 草茎点霉粗毒素对鸭跖草叶片的毒性反应  105-106
      2.4 草茎点霉粗毒素对鸭跖草植株生长量的影响  106-107
      2.5 草茎点霉粗毒素的杀草谱和作物安全性评价  107-108
    3 小结  108-109
  第二节 草茎点霉粗毒素的提取工艺研究  109-119
    1 材料与方法  109-112
    2 结果与分析  112-117
      2.1 草茎点霉粗毒素提取方法的确定  112-113
      2.2 草茎点霉产毒条件的确定  113-116
      2.3 粗毒素稳定性的确定  116-117
    3 小结  117-119
第七章 草茎点霉粗毒素作用机理研究  119-129
  1 材料与方法  119-122
  2 结果与分析  122-127
    2.1 毒素对鸭跖草叶片细胞膜透性的影响  122
    2.2 毒素对鸭跖草叶片细胞内Na~+和K~+渗漏量的影响  122-124
    2.3 毒素对鸭跖草叶片细胞内MDA渗漏量的影响  124
    2.4 毒素对鸭跖草叶片叶绿素含量的影响  124-125
    2.5 毒素对鸭跖草叶片呼吸作用的影响  125
    2.6 毒素对鸭跖草叶片细胞内CAT活性的影响  125-126
    2.7 毒素对鸭跖草叶片细胞内POD活性的影响  126-127
    2.8 毒素对鸭跖草叶片细胞内APX活性的影响  127
  3 小结  127-129
第八章 草茎点霉毒素对环境生物安全性评价研究  129-139
  1 材料与方法  129-132
  2 结果与分析  132-137
    2.1 毒素对家蚕的危害性评估结果  132-134
    2.2 毒素对蜜蜂的危害性评估结果  134
    2.3 毒素对鱼的危害性评估  134
    2.4 毒素对松毛虫赤眼蜂的危害性评估结果  134
    2.5 毒素对蚯蚓的危害性评估结果  134-135
    2.6 毒素对蚤状蚤的危害性评估结果  135-136
    2.7 毒素对小球藻的危害性评估结果  136-137
    2.8 毒素对土壤主要微生物类群的影响  137
  3 小结  137-139
第九章 草茎点霉毒素的纯化和结构初步解析研究  139-158
  1 材料与方法  139-145
  2 结果与分析  145-157
    2.1 毒素薄层层析展层剂的筛选  145
    2.2 胞内和胞外粗毒素活性成分的检测  145-148
    2.3 草茎点霉粗毒素的纯化  148-153
    2.4 除草毒素结构初步分析  153-157
  3 本章小结  157-158
第十章 结论与讨论  158-168
  1.鸭跖草病原真菌的选择  158-159
  2.草茎点霉SYAU-06菌株的生物学特性  159-160
  3.草茎点霉SYAU-06菌株侵染鸭跖草的影响因子  160-162
  4.草茎点霉粗毒素的除草潜力  162-163
  5.粗毒素的提取工艺  163-164
  6.草茎点霉粗毒素的作用机理  164-165
  7.草茎点霉粗毒素对环境生物的安全性  165-166
  8.草茎点霉粗毒素的纯化和结构鉴定  166-168
参考文献  168-180
致谢  180-181
附录  181-182

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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