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玉米与大豆群落捕食者捕食行为的DNA标记检测与控害作用的FQ-PCR量化评价

作　者: 宋新元
导　师: 丛斌
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 群落害虫捕食者 DNA分子标记控害作用量化评价
分类号: S476.2
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

可持续农业与害虫生态管理策略要求以生态系统为调控单位,充分发挥自然控制力,以达到治理有害生物和维护自然平衡的目的。捕食者作为一种重要的自然控制力是调节害虫种群密度、维持自然生态平衡的关键因子。无疑,准确评价捕食者在生态群落中所处的营养地位及精确量化评估其控害能力是应用捕食类群进行生物防治的基础。然而,捕食者尤其是广食性捕食者食物谱复杂且存在一定的选择性,加之研究理念、技术支持等条件的限制,对其所进行的研究与利用工作一直没有突破性进展,成为困扰生态学家与害虫防治学家的研究瓶颈之一。近年来,日趋成熟的DNA分子标记技术为探索群落内营养联系提供了有利的工具,同时荧光定量PCR技术的迅猛发展也为量化研究天敌对害虫的控制作用提供了新的契机。本研究立足玉米田与大豆田害虫与天敌群落,以DNA分子标记与荧光定量PCR技术为工具,准确定性研究群落内天敌对害虫的捕食行为,并拟和各种影响因子,精确定量研究主要天敌对靶标害虫的控制作用,对科学管理害虫、充分利用捕食性天敌、评估引进生物风险和治理有害生物入侵等工作具有重要意义。具体研究内容与结论如下:1基本明确沈阳地区玉米田与大豆田主要害虫与天敌群落结构及动态玉米田群落中主要害虫与天敌共50种,其中害虫17种,天敌33种。害虫类群中玉米蚜和禾缢管蚜相对多度最大,分别为46.86%和32.69%;并在7月25日至8月19日期间为优势害虫种群。天敌类群中,蜘蛛类相对多度最大为4.28%,其次为异色瓢虫与大草蛉,相对多度分别占1.25%和1.02%;大部分时间蜘蛛类为优势天敌种群。玉米田群落在6月15日和7月20日两个时期,多样性与均匀度指数同时达到峰值,是维持物种间相互组合抵抗外界干扰和恢复自然平衡的最佳时期,应予以保护。大豆田群落中主要害虫与天敌共41种,其中害虫15种,天敌26种。害虫类群中,大豆蚜和烟蓟马相对多度最大,分别为55.28%和27.59%;并且在大部分时间为优势害虫种群。天敌类群中,东亚小花蝽相对多度最大为2.97%,其次为蜘蛛类与大草蛉,分别为1.71%和0.54%;大部分时间东亚小花蝽为优势天敌种。大豆田群落多样性与均匀度指数在6月15日至6月25日、7月30日至8月14日两个时期较低,群落最不稳定。其余大部分时期群落多样性与均匀度指数维持在较高水平,是维持物种间相互组合抵抗外界干扰和恢复自然平衡的最佳时期,应予以保护。2利用DNA分子标记技术研究玉米田与大豆田群落内捕食行为2.1 COⅠ基因标记检测天敌对大豆蚜的捕食作用设计大豆蚜COⅠ基因特异片段扩增引物2对(A和B),扩增片段大小分别为197 bp和253 bp。检测田间捕食者对大豆蚜的捕食作用,结果表明,异色瓢虫成虫和幼虫、草蛉成虫、东亚小花蝽成虫和若虫捕食大豆蚜的作用较强,其阳性比率分别为61.90%和80.00%、78.57%、57.14%和62.50%。同时田间检测尚表明,捕食性天敌群体总的阳性比率与大豆蚜的种群密度呈显著正相关。2.2 COⅡ基因标记检测天敌对玉米蚜的捕食作用筛选玉米蚜COⅡ基因特异片段扩增引物(ClaCOⅡF/R3),其扩增片段为339bp,检测田间捕食者对玉米蚜的捕食作用,结果表明,大灰食蚜蝇幼虫、草蛉幼虫、异色瓢虫成虫和幼虫、龟纹瓢虫成虫和幼虫捕食玉米蚜的作用较强,其阳性比率分别为66.67%、60.00%、44.83%和46.15%、45.00%和57.14%。2.3 COⅡ基因标记检测天敌对禾缢管蚜的捕食作用筛选禾缢管蚜COⅡ基因特异片段扩增引物(BcoaCOⅡF4/R2),其扩增片段为148bp,检测田间捕食者对禾缢管蚜的捕食作用,结果表明,大灰食蚜蝇幼虫、异色瓢虫成虫和幼虫、草蛉成虫和幼虫、龟纹瓢虫幼虫捕食禾缢管蚜的作用较强,其阳性比率分别为55.56%、55.00%和46.15%、40.00%和50.00%、42.86%。2.4东亚小花蝽捕食朱砂叶螨的DNA分子标记检测克隆并测序朱砂叶螨COⅠ基因一段大小为480bp的序列,并借此设计朱砂叶螨特异片段扩增引物1对(C),其扩增目的片段为158bp。利用PCR方法鉴定了东亚小花蝽成虫及若虫对朱砂叶螨的捕食作用。2.5玉米田与大豆田捕食者对异色瓢虫与大草蛉捕食作用的DNA分子标记检测克隆并测序异色瓢虫COⅠ基因一段大小为500bp的序列,并借此设计异色瓢虫特异片段扩增引物1对(D),其扩增目的片段为293bp。根据草蛉16S ribosomal RNA基因序列(登陆号为AY620151),设计大草蛉特异片段扩增引物1对(E),其扩增片段为193bp。利用所设计引物,分别检测田间捕食者腹内食物成分,结果表明,捕食者类群内部存在捕食行为。大草蛉、步甲和蜘蛛类对异色瓢虫具有捕食能力,其中大草蛉成虫检出率最高,玉米田中为33.33%,大豆田中为40.00%;只有蜘蛛类对大草蛉存在捕食行为,玉米田中检出率为33.33%,大豆田中为25.00%。3构建荧光定量PCR体系量化研究田间捕食性天敌腹内目标害虫成分的含量制作玉米蚜、禾缢管蚜绝对定量标准品,并分别构建荧光定量PCR体系。对田间捕食者进行检测表明,大草蛉幼虫腹内含有的玉米蚜COⅡ基因拷贝量最大;其次依次为大草蛉成虫、异色瓢虫幼虫、成虫、大灰食蚜蝇幼虫;再次为龟纹瓢虫成虫、幼虫;蜘蛛类和东亚小花蝽成虫腹内含有的玉米蚜COⅡ基因拷贝数最少;步甲类腹内未检测到玉米蚜COⅡ基因成分。检测田间捕食者对禾缢管蚜的捕食作用,结果表明,大草蛉成虫腹内含有禾缢管蚜COⅡ基因拷贝量最大,其次依次为大草蛉幼虫、异色瓢虫幼虫、成虫;再次为大灰食蚜蝇幼虫、龟纹瓢虫幼虫、成虫;蜘蛛类和东亚小花蝽成虫腹内禾缢管蚜COⅡ基因拷贝数最少;步甲类腹内未检测到禾缢管蚜COⅡ基因成分。4荧光定量PCR量化研究目标害虫在主要天敌腹内的衰变规律异色瓢虫成虫喂饲单头玉米蚜,自然消化0,2,4,6h后,可检测到目标片段的拷贝数分别为991.5471、101.1695、20.6750、0个,时间与拷贝数对数的相关关系式为:A=-0.4203B+2.9458(R~2=0.9894);大草蛉成虫喂饲单头玉米蚜,自然消化0,2,4,6h后可检测到目标片段的拷贝数分别为942.9212、565.5247、121.4485、0个,时间与拷贝数对数的相关关系式为:C=-0.2225D+3.0483(R~2=0.9228)。异色瓢虫成虫喂饲单头禾缢管蚜,自然消化0,2,4,6h后可检测到目标片段的拷贝数分别为2304.2586、125.7857、6.1939、0个,时间与拷贝数对数的相关关系式为:E=-0.6427 F+3.3705(R~2=0.998);大草蛉成虫喂饲单头禾缢管蚜,自然消化0,2,4,6h后可检测到目标片段的拷贝数分别为1605.2458、576.1685、86.0061、0个,时间与拷贝数对数的相关关系式为:G=-0.3177 H+3.2689(R~2=0.970)。5量化评价主要天敌对目标害虫的控制作用拟和天敌发生数量、阳性比率、腹内目标害虫成分含量及目标害虫在天敌腹内的衰变速率四个因素评价7月31日至8月14日期间异色瓢虫成虫与大草蛉成虫对玉米蚜的控制能力,结果表明,异色瓢虫成虫对玉米蚜的控制作用(R=6.1429×10~6)强于大草蛉成虫(R=2.7967×10~6);评价异色瓢虫成虫与大草蛉成虫对禾缢管蚜的控制能力,结果表明,异色瓢虫成虫对禾缢管蚜的控制作用(R=15.4896×10~6)亦强于大草蛉成虫(R=8.4966×10~6)。

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