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脂肪间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

作　者: 乔晓俊
导　师: 杨波
学　校: 郑州大学
专　业: 神经外科
关键词: 脂肪间充质干细胞 脊髓损伤 尾静脉移植 BBB评分 免疫组织化学
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景及目的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是中枢神经系统的严重创伤,因其高致残率和高病死率成为医学研究难点,但随着神经生物学和再生医学研究的不断深入,干细胞移植治疗SCI已成为研究热点。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)及脐血干细胞(cord blood stem cells)等多种干细胞已经在动物实验及部分临床治疗中得到验证,表明干细胞对SCI具有一定的治疗作用,但由于其来源及细胞提取量少等缺点限制了其进一步研究与临床应用。而脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)不仅摆脱了其它干细胞来源不足及伦理学限制等方面的缺点,具有组织来源广泛、细胞提取量大、易于体外培养扩增、具有良好的多向分化潜能等优点,而且有研究证实ADSCs在体外可被诱导为神经元样细胞的特性要优于其它组织来源的干细胞。目前尚未见到关于ADSCs移植治疗SCI的相关性报道。本实验为探讨ADSCs尾静脉移植后对大鼠运动功能及损伤脊髓组织中相关细胞因子表达的影响,从而判断ADSCs对SCI是否具有治疗作用及急、慢性期进行ADSCs移植对治疗效果的影响。方法细胞的培养与鉴定：无菌条件下将脂肪组织清洗、剪碎、消化、过滤,制成单细胞悬液,最后将其移入含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及20g/L碱性成纤维生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基的培养瓶中培养、传代。取培养至第4代的ADSCs细胞采用流式细胞仪分析法检测细胞表面标志物：CD29. CD3、CD44、CD45、HLA-ABC、HLA-DR。动物模型的建立及分组：采用改良Allen’s打击法制备SCI模型。将大鼠分为急性期组(A组)和慢性期组(B组)。A组和B组分别分为A1组和B1组(对照组)、A2组和B2组(假移植组)A3组和B3组(移植组)。各组大鼠以脊髓损伤后1w内评分不超过7分为入选标准。细胞标记、移植及相关观测指标：取第4代ADSCs,用含有10umol/L的5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)孵育24h,标记并收集细胞。A3与B3组大鼠分别于术后1、w、4w时以尾静脉注射途径进行ADSCs移植,A2及B2组则以等量生理盐水替代,A1与B1组不做处理。A组与B组各组大鼠分别于ADSCs移植后第3d、1w、2w、3w、4w进行BBB运动功能评分并分批处死大鼠收集受损节段脊髓组织,采用免疫组织化学(SP)染色法观察各组受损节段脊髓组织病理学变化、细胞迁移及分化情况,并观察GFAP、NSE、Nestin、SYN等相关神经因子表达情况。结果A3组和B3组大鼠BBB(Basso, Beattie, Bresnahan locomotor scales)运动功能评分于ADSCs移植后4w明显高于对照组和假移植组,A3组和B3组BBB评分为15.33±1.21和13.66±1.03,A1组和A2组为9.60±1.34和10.00±1.87,B1组及B2组为10.60±1.82、10.80±2.05,移植组与对照组和假移植组之间差异显著(P<0.05),而假移植组和对照组无明显差异(P>0.05)。免疫组化结果显示,A3组和B3组在ADSCs移植后第3d发现受损脊髓组织有被Brdu标记的ADSCs,A3组与B3组迁移细胞数分别为每高倍镜下15.03±3.67、10.27±3.13,两组差异明显(P=0.024)；A3组于ADSCs移植后1w GFAP阳性率开始降低,其阳性表达面积比为4.33%±1.58%,A1和A2组为8.68%±2.09%、8.88%±2.33%,A3组低于A1、A2组(P=0.002)；B1、B2、B3组于ADSCs移植后4w GFAP阳性表达面积比分别为4.92%±1.38%、4.52%±1.41%、4.68%±1.35%,三组无明显差别(P=0.253)；A3组和B3组于ADSCs移植后2w NSE、Nestin、SYN阳性表达面积比分别为2.33%±1.56%、1.83%±1.44%、0.97%±1.13%和1.53%±1.28%、1.03%±1.22%、0.56%±0.65%,A3组和B3组NSE表达低于对照组及假移植组(P<0.05),Nestin、SYN表达高于对照组和假移植(P<0.05)；慢性期各组GFAP、NSE表达低于急性期(P<0.05),A3组Nestin、SYN的表达高于B3组(P<0.05)。结论1.经尾静脉移植ADSCs,可在受损脊髓组织局部见到被标记的ADSCs,认为ADSCs可迁移至受损脊髓组织。2. ADSCs移植后,可降低GFAP及NSE表达,提高Nestin、SYN的表达,增加BBB评分,说明ADSCs经静脉移植可促进SCI大鼠受损脊髓组织功能的恢复。3.急性期行ADSCs移植对SCI大鼠运动功能恢复优于慢性期,SCI后早期行ADSCs移植可更有效改善受损脊髓组织功能。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-11
中英文缩略词对照表  11-12
前言  12-14
材料与方法  14-22
结果  22-28
讨论  28-36
结论  36-37
附图  37-43
参考文献  43-49
综述 脊髓损伤机制及其干细胞治疗研究现状  49-65
  参考文献  59-65
个人简历  65
攻读硕士学位期间发表论文  65-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 头部及神经外科学 > 脊髓
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