重组人睫状神经营养因子保护效应的研究目的研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)不同给药途径对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型的制作;实验组分别给予rhCNTF静脉、前房、玻璃体内注" />
学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

视神经损伤后睫状神经营养因子神经保护效应的研究

作 者: 雷德强
导 师: 赵洪洋
学 校: 华中科技大学
专 业: 外科学
关键词: 重组人睫状神经营养因子 视神经损伤 视觉诱发电位 逆行神经示踪 神经移植 超顺磁氧化铁 增强型绿色荧光蛋白 睫状神经营养因子 神经干细胞
分类号: R779.1
类 型: 博士论文
年 份: 2009年
下 载: 181次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
 

内容摘要


第一部分视神经不全损伤后睫状神经营养因子 的学位论文">重组人睫状神经营养因子保护效应的研究目的研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)不同给药途径对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型的制作;实验组分别给予rhCNTF静脉、前房、玻璃体内注射,对照组给予生理盐水;术后15天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪;不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测;术后30天原位心脏灌注;视网膜铺片,视网膜神经节细胞计数;取术侧视神经组织,光镜和电镜观察各组视神经形态变化;视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果对照组术侧眼P-VEP P-100较实验各组振幅明显减低,潜伏期明显延长,差异显著(P<0.01);与对照组相较,实验组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P<0.01),神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后rhCNTF不同途径给药均具有视神经保护效应,但效应存在差异,以玻璃体注射疗效最佳。第二部分重组人睫状神经营养因子联合坐骨神经移植促进视神经损伤后轴突再生的实验研究目的探讨重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)联合坐骨神经移植对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型,并行视网膜坐骨神经移植;CNTF组给予rhCNTF玻璃体内注射,空白对照组给予生理盐水;术后15天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪,坐骨神经残端Fluoro-Gold逆行神经示踪;不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测;术后30天原位心脏灌注;视网膜铺片,视网膜神经节细胞计数;取术侧视神经组织,光镜和电镜观察各组视神经形态变化;视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果空白对照组术侧眼P-VEP P-100较CNTF组振幅明显减低,潜伏期明显延长,差异显著(P<0.01);与空白对照组相较,CNTF组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P<0.01),神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后CNTF联合坐骨神经移植具有协同视神经保护效应。第三部分绿色荧光蛋白、超顺磁氧化铁纳米粒子双标CNTF基因修饰神经干细胞的研究目的1.完成胚胎大鼠神经干细胞分离、培养、传代及鉴定;2.构建睫状神经营养因子(CNTF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达;3.建立超顺磁氧化铁(SPIO)、绿色荧光蛋白(EGFP)双标睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰神经干细胞(NSCs)。方法1.显微解剖分离E14d胚胎大鼠脑组织,用机械吹打法制成单细胞悬液,接种于含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)及N2的DMEM/F12(1:1)无血清培养基中培养,克隆球形成后进行传代培养。取第三代培养的细胞分别进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后GFAP、CNPase、β-Ⅲ-tubulin免疫细胞化学鉴定。2.应用RT-PCR从U-251细胞总RNA中扩增出CNTF CDS,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1-CNTF,经酶切鉴定及序列分析后,转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学、RT-PCR和western blot鉴定CNTF在细胞内的表达。3.重组质粒pEGFPN1-CNTF采用核转染技术转入大鼠胚胎神经干细胞,G418筛选建立CNTF基因修饰神经干细胞,SPIO标记细胞。应用免疫细胞化学、RT-PCR和western blot鉴定CNTF在基因修饰NSCs中的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记率;诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果1.E14d胚胎大鼠脑组织细胞培养72h后可形成悬浮生长的神经球,6-7d后即可传代;经传代扩增后得到大量同源的Nestin免疫阳性的细胞克隆球,经诱导分化后细胞呈GFAP、CNPase和β-Ⅲ-tubulin免疫阳性。2.RT-PCR产物为622bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-CNTF经双酶切产生618bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果一致,其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、RT-PCR和westernblot结果表明CNTF蛋白能在COS-7细胞中正确表达。3.重组质粒pEGFPN1-CNTF转染NSCs12h后EGFP开始表达;免疫细胞化学、RT-PCR和western blot表明CNTF能正确表达;普鲁士蓝染色示标记细胞内可见大量蓝染颗粒,透射电镜示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内;体外诱导分化研究表明SPIO、EGFP双标记不影响其分化。结论成功建立了CNTF真核表达质粒pEGFPN1-CNTF和SPIO、EGFP双标CNTF基因修饰神经干细胞。第四部分睫状神经营养因子基因修饰神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰神经干细胞联合坐骨神经移植对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型,并行视网膜坐骨神经移植;联合移植组给予CNTF基因修饰神经干细胞玻璃体内注射,神经移植组给予rhCNTF玻璃体内注射;术后165天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪,坐骨神经残端Fluoro-Gold逆行神经示踪;不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测;术后180天原位心脏灌注;视网膜铺片,视网膜神经节细胞计数;取术侧视神经组织,光镜和电镜观察各组视神经形态变化;视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果神经移植组术侧眼P-VEP P-100较联合移植组振幅明显减低,潜伏期明显延长,差异显著(P<0.01);与神经移植组相较,联合移植组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P<0.01),神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后CNTF基因修饰神经干细胞联合坐骨神经移植具有协同视神经保护效应。

全文目录


中文摘要  7-10
Abstract  10-15
缩略词表  15-17
前言  17-21
  参考文献  20-21
材料与方法  21-49
  一、主要实验仪器与设备  21-22
  二、主要试剂和药品  22-27
  三、实验动物  27
  四、细胞株与菌株  27
  五、质粒载体  27-28
  六、总方法与步骤  28-49
第一部分 视神经损伤睫状神经营养因子 的学位论文">重组人睫状神经营养因子神经保护效应的研究  49-64
  材料与方法  50-53
  结果  53-60
  讨论  60-63
  参考文献  63-64
第二部分 重组人睫状神经营养因子联合坐骨神经移植促进视神经损伤后轴突再生的实验研究  64-77
  材料与方法  65-67
  结果  67-73
  讨论  73-76
  参考文献  76-77
第三部分 绿色荧光蛋白、超顺磁氧化铁纳米粒子双标CNTF基因修饰神经干细胞的建立  77-116
  实验一 胚胎大鼠神经干细胞的分离培养与鉴定  78-85
    材料与方法  78-79
    结果  79-83
    讨论  83-85
  实验二 人睫状神经营养因子基因真核表达载体的构建  85-102
    材料与方法  85-90
    结果  90-100
    讨论  100-102
  实验三 GFP、SPIO双标CNTF基因修饰神经干细胞的建立  102-113
    材料与方法  102-104
    结果  104-110
    讨论  110-113
  参考文献  113-116
第四部分 睫状神经营养因子基因修饰神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究  116-130
  材料与方法  117-119
  结果  119-126
  讨论  126-129
  参考文献  129-130
全文总结  130-131
综述  131-139
攻读学位期间发表论文情况  139-141
致谢  141

相似论文

  1. 异丙威影响神经发育主要细胞的迁移分化及突起生长的体外研究,R329
  2. SHH-N信号通路及其靶基因N-myc对神经干细胞增殖的影响,R329
  3. 大鼠脑积水侧脑室周围神经干细胞的实验研究,R742.7
  4. 移植段神经与周围血管伴行修复长段神经损伤的研究,R651.3
  5. IBS模型大鼠内脏感觉投射的HRP追踪研究,R574
  6. PirB蛋白在发育期和损伤后BALB/c小鼠视觉通路的表达变化及其意义的实验研究,R774.6
  7. 双眼形觉剥夺成年大鼠视皮层可塑性与CSPGs和tPA表达关系的研究,R77
  8. 水稻叶绿体表达载体的构建及遗传转化,S511
  9. 已治愈单眼弱视患者多焦视觉诱发电位的研究,R777.44
  10. VEGF转染NSCs治疗新生脑瘫大鼠的实验研究,R742.3
  11. IKVAV-PA联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究,R651.2
  12. 百草枯对人胚胎神经干细胞损伤的机制研究,R285
  13. 小鼠囊胚与黑色素瘤细胞体外共培养模型优化,Q813
  14. BDNF和bFGF对全脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞的影响,R743.3
  15. MCMV感染对神经干细胞Wnt信号通路上游分化相关靶基因蛋白Wnt-3和Wnt-7a表达的影响,R741
  16. 大鼠坐骨神经损伤后不同时间窗吻合术后应用CNTF对脊髓运动神经元保护作用的研究,R651.3
  17. Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达,R541.4
  18. BDE-209对体外培养神经干细胞增殖分化及凋亡的影响,R329
  19. 不同留针时间的针刺诱导对新生儿鼠缺血缺氧性脑损伤脑内源性神经干细胞的影响,R245
  20. 基于水平集和局部灰度阈值的神经干细胞序列图像的分割算法,TP391.41
  21. 大麻素受体对神经干细胞分化后神经突起生长的影响及其信号转导机制,Q42

中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 眼损伤与异物
© 2012 www.xueweilunwen.com