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转录因子Snail家族在EMT中对CD147转录调控机制的研究

作　者: 茹凝玉
导　师: 边惠洁
学　校: 第四军医大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 上皮-间质转化 CD147 Slug TGF-β1 转录调控
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界常见恶性肿瘤,每年造662 000人死亡,其中80%是在发展中国家。其病情进展快、恶性程度高、治疗难度大、疗效差,5年生存率低于10%。CD147分子属于免疫球蛋白超家族,是高度糖基化的跨膜蛋白。CD147在肿瘤细胞膜上呈现高表达的状态,与肿瘤的侵袭、转移、肿瘤细胞的生长和存活密切相关。CD147通过诱导邻近成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)促进肿瘤细胞的侵袭和转移。CD147是广泛癌标志物,与肝癌等多种肿瘤的诊断和预后相关。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤进程中的重要现象。在此过程中,固定于基底膜的极化上皮细胞转变为具有运动能力的间质样细胞,并伴随着侵袭能力的增强,具有赘生细胞的特点。同时上皮标志物E-钙粘素、-连环蛋白和γ-连环蛋白下调,间充质标志物N-钙粘素、波形蛋白、纤维结合蛋白上调。在多种EMT诱导因子中,转化生长因子-β(transforming growth factor-,TGF-β)常表达于慢性肝病的微环境中,作为一种重要的细胞因子发挥作用。TGF-β通过经典的Smads依赖通路和Smads非依赖通路引起EMT发生并维持细胞的间质特性。Smads非依赖通路包含Ras、p38 MAPK、PI3K/Akt通路等。尽管有这些证据,TGF-β在肝癌发生中的作用及参与EMT的具体分子机制依然不明。转录水平的调控是真核生物基因表达调控中最重要的环节,转录起始阶段只有转录因子的特异性结合才能有效起始转录。转录因子Snail家族成员在EMT中处于中心地位。Snail家族成员包含Snail1和Snail2(也称为Slug)。Snail家族的转录因子具有锌指结构,包含4-6个锌指结构的高度保守的羧基末端和多变的氨基末端区域。Snail蛋白中心区域是丝氨酸-脯氨酸富含区域,在Snail家族成员间不同,Snail1的核输出信号(nuclear export signal,NES)结构域控制着Snail1的出核,Snail2包含Slug结构域。Snail家族成员可与靶基因上含有CANNTG的核心碱基序列的E-box作用元件结合,从而调节其下游基因的表达。我们通过前期实验证实,TGF-β1诱导CD147表达并参与EMT发生,但是TGF-β1如何调节CD147的表达并未被揭示,本研究旨在从转录因子的角度深入探讨CD147表达的调控机制。本论文的研究目标为:首先确定CD147上是否存在转录因子Snail家族成员的结合位点;其次分析影响转录因子家族成员表达是否影响CD147表达;最后,通过检测肝癌样本中转录因子与CD147表达,对其相关性进行进一步确定。第一部分:TGF-β1调节转录因子Snail家族成员与CD147的上调表达通过实时定量PCR证实,在正常肝细胞QZG中给予TGF-β1刺激, Snail1和Slug表达上调,同时CD147上调表达。siRNA干涉Snail1表达,可以抑制TGF-β1引起的Snail1和CD147表达上调,却并没有直接影响CD147表达。siRNA干涉Slug表达,可以直接下调CD147表达。在mRNA水平下调Snail1的表达,则影响Slug的表达,说明Snail1位于Slug的上游。Western blot在蛋白水平上也验证了下调Slug在一定程度上影响CD147表达。第二部分:转录因子Slug对CD147分子的直接转录调控作用首先我们构建Snail1和Slug的表达载体,与含CD147启动子上游1761 bp全长的荧光素酶载体共转入细胞,从而确定Snail1和Slug是否对CD147的表达具有直接调控作用。荧光素酶报告基因结果显示,将Snail1与含CD147启动子上游1 761 bp全长的荧光素酶载体共转入细胞,Snail1不能引起荧光素酶报告基因活性的上升,而Slug可以引起荧光素酶报告基因活性的上升,表明Slug调控CD147的表达。为进一步验证该结论,我们将Snail1的表达载体与CD147上游1 761 bp、644 bp、338 bp的荧光素酶分段载体共转染入细胞,实验结果证实,Snail1不能引起荧光素酶报告基因活性的上升;而位于CD147启动子上游-563到-558区域的E-box2,对于Slug调控CD147表达是必须的。我们进一步将E-box2 CAGGTG突变为AAGGTA,突变后的E-box2不能引起CD147启动子区荧光素酶报告基因活性的上升。最后通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)证实,转录因子Slug直接调控CD147表达。第三部分:转录因子Slug和CD147分子在肝癌样本中的表达相关性分析我们通过免疫组化的方法检测了肝血管瘤旁肝组织、肝炎组织、肝硬化组织及肝癌组织中的CD147表达情况。所有25例肝血管瘤旁肝组织和12例肝炎组织中,CD147均为阴性;24例肝硬化组织中均为阳性;49例高、中、低分化肝癌组织中有37例为阳性(75.5%),与肝血管瘤旁肝组织相比具有统计学差异(P<0.001)。在肝癌组织中,CD147与Slug的表达呈正相关(rs=0.3064,P=0.0323)。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-17
文献回顾  17-31
  1 CD147 分子的研究进展  17-20
    1.1 CD147 的基因结构  17-18
    1.2 CD147 分子的功能  18-19
    1.3 CD147 分子在肿瘤中的作用  19-20
    1.4 CD147 分子的转录调控机制研究  20
  2 EMT 研究进展  20-31
    2.1 EMT 概论  20-23
    2.2 EMT 的调控机制  23-29
    2.3 EMT 在肿瘤侵袭转移中的作用  29
    2.4 EMT 与临床研究  29-31
第一部分：TGF-β1 调节转录因子Snail 家族成员与CD147 的上调表达  31-44
  1 材料  31-32
  2 方法  32-37
  3 结果  37-42
  4 讨论  42-44
第二部分：转录因子Slug 对CD147 分子的转录调控作用  44-61
  1 材料  44-47
  2 方法  47-54
  3 结果  54-59
  4 讨论  59-61
第三部分：转录因子Slug 和CD147 分子在肝癌样本中的表达相关性分析  61-65
  1 材料  61-62
  2 方法  62
  3 结果  62-64
  4 讨论  64-65
小结  65-66
参考文献  66-78
个人简历和研究成果  78-80
致谢  80

转录因子Snail家族在EMT中对CD147转录调控机制的研究

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