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shRNA对食管鳞癌EC9706细胞p70S6K1表达的影响

作　者: 郭三星
导　师: 薛乐勋
学　校: 郑州大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 食管鳞状细胞癌 70 kDa核糖体S6激酶1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

食管鳞癌是我国北方最常见的消化道恶性肿瘤之一,尤其是河南省林县发病率最高。手术治疗、化学治疗、放射治疗以及生物治疗为主的综合治疗,使食管癌治疗有了较快的发展。但是,食管鳞癌发生的确切机理仍然不清楚。因此,如何提高食管鳞癌的早期诊断率,以及抗肿瘤药物的开发仍然是个巨大的挑战。70kDa核糖体S6激酶1(70 kDa ribosomal S6 kinase 1, p70S6K1)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的一个重要的下游靶蛋白,能够调节肿瘤细胞生长、周期进展和存活。在细胞信号通路网络中发挥着复杂的作用。当前研究的热点主要是mTOR抑制剂,现在有多种mTOR抑制剂已经进入临床试验,并取得了初步成效。mTOR抑制剂也能够改变肿瘤的放化疗敏感性。而针对p70S6K1的阻断策略的研究还很少,且p70S6K1的活化水平与mTOR抑制剂的敏感性的关系还有待进一步研究。因此,本课题试图构建p70S6K1特异性抑制的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,并检测其对食管鳞状细胞癌细胞(Esophageal squamous cell careinoma cell, ESCCC)株EC9706细胞p70S6K1 mRNA和磷酸化p70S6K1(phosphated p70S6K1, p-p70S6K1)蛋白表达的影响,而能够选择出干扰效果较好的p70S6K1特异性shRNA表达载体,为进一步研究p70S6K1在细胞内的生物学功能提供有效地工具。方法1 shRNA表达载体构建根据siRNA设计原则,在Ambion公司网站设计并选取3个p70S6K1特异性靶序列,而设计合成正反义DNA片段,3’端添加5个T,作为RNA聚合酶Ⅲ的终止子,两端加酶切位点。合成的正反义65 nt寡核苷酸链经退火形成双链DNA(double strand DNA, dsDNA),并与线性的pSIREN-RetroQ-DsRed-Express载体连接,得到重组质粒,分别命名为p1shRNA-p70S6K1、p2shRNA-p70S6K1和P3shRNA-p70S6K1。转化感受态细菌,在氨苄抗性培养基中37℃过夜培养,挑取阳性克隆,送菌液测序鉴定。2转染EC9706细胞根据LipofectamineTM2000转染试剂晚明书步骤,将重组质粒p1shRNA-p70S6K1转染EC9706细胞。实验分两组①对照组(无质粒脂质体转染);②实验组(质粒转染组)；转染24 h时在荧光显微镜下观察红色荧光表达。3 RT-PCR应用]RT-PCR实验分别检测转染后24、48、72、96和120 h p70S6K1 mRNA表达的变化情况,实验重复三次。4 Western blotting采用Western blotting实验检测转染后24、48、72、96和120 h p-p70S6K1表达的变化情况,实验重复三次。5图像处理和统计学分析使用图像处理软件IPP5.0.2对RT-PCR和Western blotting实验图片进行灰度值分析。应用SPSS 10.0软件,采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA),P值<0.01有统计学意义；采用最小有意义差异(least significant difference,LSD)t检验进行两两比较,P值<0.05有统计学意义。结果1重组质粒的鉴定通过测序鉴定,报告显：pSIREN-RetroQ-DsRed-Express载体连接序列与设计序列完全相符。2荧光表达重组质粒转染EC9706细胞24h后,在荧光显微镜下观察到红色荧光表达。3 RT-PCR结果与对照组相比,p70S6K1 mRNA表达在转染后24h、48h和72h下调(P值均<0.05),其中,在转染48h达到最大抑制率,最大干扰效率为55.3%。4 Western blotting结果与对照组相比,p-p70S6K1(Th389)表达在转染后24h、48h、72h和96h下调(P值均<0.05),其中,在转染48h达到最大抑制率,最大干扰效率约为58.0%。讨论本研究应用RNA干扰技术构建p70S6K1特异性干扰载体。实验已经初步证实：所构建得p70S6K1特异性shRNA表达载体,转染食管鳞癌细胞株EC9706细胞后,能够在mRNA水平和蛋白水平对p70S6K1表达实现抑制。这就为我们进一步研究p70S6K1在细胞中的复杂作用提供了工具。转染食管癌细胞后p70S6K1的表达从mRNA水平和蛋白水平都经历了先下降,至48h是降至最低,后又上升至对照组水平。在这个过程中可能是由于随着转染时间的推移,转染进入细胞的质粒出现丢失,而不表达shRNA所致。因此,我们还要在转染技术方面进行提高,从而延长转染质粒的作用时间。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-13
1 引言  13-15
2 p70S6K1特异性shRNA表达载体的构建  15-26
  2.1 材料  15-19
    2.1.1 仪器与设备  15
    2.1.2 主要试剂  15-16
    2.1.3 常用培养基及液体试剂的配置  16
    2.1.4 载体及菌株  16-17
    2.1.5 RNA干扰靶序列  17-18
    2.1.6 shRNA表达片段  18-19
  2.2 重组质粒的构建  19-23
    2.2.1 质粒酶切  19
    2.2.2 酶切产物胶回收及纯化  19-20
    2.2.3 载体的连接  20
    2.2.4 质粒的转化  20-21
    2.2.5 测序鉴定  21
    2.2.6 重组质粒的提取及浓度测定  21-23
  2.3 结果  23
    2.3.1 测序鉴定  23
    2.3.2 质粒浓度及纯度  23
  2.4 讨论  23-25
  2.5 小结  25-26
3 plshRNA-p70S6K1在EC9706细胞中功能初步分析  26-43
  3.1 材料  26-30
    3.1.1 主要仪器设备  26-27
    3.1.2 主要试剂与试剂盒  27-28
    3.1.3 细胞株和载体  28
    3.1.4 引物序列  28
    3.1.5 常用培养基及液体试剂的配置  28-30
  3.2 方法  30-37
    3.2.1 细胞培养  30
    3.2.2 shRNA表达载体转染EC9706细胞  30
    3.2.3 荧光显微镜下观察  30-31
    3.2.4 RT-PCR实验方法  31-33
    3.2.5 Western blotting实验方法  33-37
    3.2.6 统计学处理方法  37
  3.3 结果  37-40
    3.3.1 转染细胞荧光表达  37-38
    3.3.2 细胞总RNA的提取  38
    3.3.3 RT-PCR结果  38-39
    3.3.4 Western blotting结果  39-40
  3.4 讨论  40-41
  3.5 小结  41-43
4 结论  43-44
参考文献  44-47
综述 mTOR信号通路在抗肿瘤化疗耐药中的作用  47-66
  参考文献  60-66
附录A shRNA表达片段的测序结果图  66-69
在学期间发表的学术论文  69-70
致谢  70

shRNA对食管鳞癌EC9706细胞p70S6K1表达的影响

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