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剪切因子FBP21双WW结构域的溶液结构和生物学功能研究

作　者: 黄小娟
导　师: 施蕴渝；吴季辉
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: FBP21 双WW结构域核磁共振波谱前体mRNA剪切蛋白-蛋白相互作用
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

在真核细胞中,编码基因的表达是基因经过转录、mRNA加工、翻译、产生有生物活性的蛋白质的复杂过程。这些过程通过庞大而精细的核酸-核酸,核酸-蛋白,蛋白-蛋白相互作用彼此密切关联,形成高度精密的基因表达调控网络。其中前体mRNA的剪切在细胞核中由剪切体复合物催化完成的。剪切体是由5个小核RNAs和几百种蛋白质组成的高度动态变化的核糖核蛋白颗粒。小核糖核蛋白颗粒(snRNPs)和大量的蛋白因子是形成有活性的剪切体所必需的。在芽殖酵母中,剪切因子Prp40通过和剪切分支点蛋白BBP以及U5 snRNP蛋白Prp8相互作用在前体mRNA剪切过程中起内含子两端的搭桥作用。Prp40通过2个WW结构域与5’端剪切位点和BBP相互作用拉近了5’端剪切位点和分支点的空间距离从而起到了建立桥梁的作用。这种相互作用被认为在哺乳动物细胞中是保守的。FBP21 (formin binding protein 21),是人源的Prp40相似蛋白,含有一个锌指结构和两个连续的第III类WW结构域,是剪切体A/B复合物的组分,是U2小核糖核蛋白颗粒(snRNPs)中的蛋白质。FBP21和剪切因子SC35以斑点状共定位在细胞核内,这种细胞核斑点是剪切因子在细胞核内的存储位点。此外,FBP21与剪切因子U1 snRNP蛋白U1C,核心snRNPs蛋白SmB/SmB’以及分支点蛋白SF1/BBP都有相互作用。这些信息都暗示了FBP21在前体mRNA剪切中有着重要作用,但是目前还没有明确剪切相关功能的研究报道。在本工作中,我们通过三维核磁共振(NMR)波谱学的方法解析了人源剪切体蛋白FBP21双WW结构域的溶液结构。这是第一个被解析的第III类WW结构域结构的报道。双WW结构域的溶液结构显示两个WW结构域间的相对取向不是固定的,而是具有一定的相对运动。通过NMR骨架弛豫动力学实验和残留偶极耦合实验,我们发现两个WW结构域的连接区域具有高度的柔性,这种柔性使得两个WW结构域间具有相互运动。我们用化学位移干扰实验和等温滴定量热实验(ITC)分析了FBP21两个WW结构域的配体识别特性和相互作用界面。结果显示,两个WW结构域在结合配体的时候有合作,这种结构域间的合作将FBP21双WW结构域对配体的亲和力提高了约60倍,而且这种合作需要两个WW结构域间的柔性连接区域参与协助。尽管已经有不少单个WW结构域结构被解析,但是已解析的双WW结构域结构目前只有2个,而且这两个结构功能差异很大。作为第三个被解析得双WW结构域结构,我们的研究显示尽管有高度相似的序列和结构域排列,不同蛋白中的双WW结构域的相互作用机理,相对空间取向和动力学特征以及其生物学功能可以是完全不同的。我们进一步研究了FBP21及其双WW结构域的生物学功能。首次报道了FBP21是一个剪切因子,通过两个第III类的WW结构域有效的激活in vivo前体mRNA的剪切。在激活前体mRNA剪切过程中,两个WW结构域必须同时参与,缺一不可。任何一个WW结构域的突变就会彻底破坏FBP21激活剪切的功能。同时,WW结构域间的连接区域也是很重要,缩短这一区域会严重影响FBP21的剪切功能。GST pull down和免疫共沉淀实验分别用于研究FBP21与剪切因子SIPP1的in vitro和in vivo相互作用。我们还用免疫荧光的方法研究了FBP21在细胞内的定位以及和剪切因子SC35共定位的情况。结果显示,FBP21与SIPP1的相互作用,在细胞内的定位同样都需要两个WW结构域同时参与,缺一不可。FBP21的各种生物学功能都需要两个WW结构域同时参与合作,并且这种合作需要其连接区域的柔性才能实现。这可以用我们结构研究的结果很好地解释:单个WW结构域的结合能力较弱,对配体的高亲和力需要两个结构域同时参与相互作用。并且两个WW结构域连接区域的柔性使他们能够同时和多个配体结合。关于FBP21结构和功能两方面的研究结果吻合的很好,我们的研究为理解FBP21生物学功能的分子机理及其双WW结构域的生物学特性提供了很好的基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第1章综述前体m RNA 剪切的研究背景  12-39
  1.1 引言  12-15
  1.2 前体mRNA 加工与剪切体大分子机器  15-25
    1.2.1 前体mRNA 的3 个加工过程  16-19
    1.2.2 剪切体(Spliceosome)：细胞内最复杂的大分子机器  19-25
  1.3 前体mRNA 的剪切与转录之间的偶联  25-30
    1.3.1 共转录前体mRNA 加工剪切的必要性  25-27
    1.3.2 前体mRNA 剪切：与转录的时间竞赛？  27-28
    1.3.3 RNAP II CTD 在转录和前体mRNA 剪切偶联中的作用  28-30
  1.4 总结  30-32
  参考文献  32-39
第2章人剪切体蛋白FBP21 双WW 结构域的结构研究  39-83
  2.1 剪切体蛋白FBP21 及其WW 结构域的介绍  39-44
    2.1.1 剪切体蛋白FBP21 的背景介绍  39-42
    2.1.2 WW 结构域的简要概述  42-44
  2.2 实验材料和方法  44-59
    2.2.1 目的基因的获得  44-45
    2.2.2 表达质粒的构建  45
    2.2.3 突变体表达质粒的构建  45-47
    2.2.4 目的蛋白的表达纯化  47-48
    2.2.5 目的蛋白的稳定性测定  48
    2.2.6 小肽的合成与纯化  48
    2.2.7 等温滴定量热实验(ITC)  48-49
    2.2.8 NMR 波谱解析人剪切体蛋白FBP21 WW1-2 的三维溶液结构  49-58
    2.2.9 化学位移扰动实验  58-59
    2.2.10 主链弛豫实验  59
    2.2.11 ~1DNH 残留欧极耦合常数（RDCs）的测定  59
  2.3 实验结果和讨论  59-76
    2.3.1 FBP21 WW1-2/ pET226(+) 重组质粒的构建  59-60
    2.3.2 FBP21 双WW 结构域蛋白的表达和纯化  60-62
    2.3.3 FBP21 双WW 结构域蛋白的CD 光谱分析  62
    2.3.4 NMR 波谱解析人FBP21 WW1-2 蛋白质的三维溶液结构  62-70
    2.3.5 FBP21 双 WW 结构域与脯氨酸多肽的相互作用  70-76
  2.4 总结  76-79
  参考文献  79-83
第3章人剪切体蛋白 FBP21 的生物学功能研究  83-126
  3.1 剪切体蛋白FBP21 的功能研究背景  83-95
    3.1.1 酵母剪切因子Prp40 在剪切体装配中的功能  84-87
    3.1.2 剪切因子SF1/BBP 在剪切体装配中的功能  87-91
    3.1.3 剪切体核心蛋白SmB/B’和U1511RNP 特异性蛋白U1C  91-95
  3.2 实验材料和方法  95-103
    3.2.1 重组质粒的构建  95
    3.2.2 抗体及其来源  95
    3.2.3 FBP21-His 和 GST-SIPP1 蛋白的表达纯化  95-96
    3.2.4 质粒DNA 的中量制备  96-97
    3.2.5 GST pull-down 实验  97
    3.2.6 Western blot 实验  97-98
    3.2.7 细胞的培养和DNA 转染  98
    3.2.8 免疫共沉淀实验  98-99
    3.2.9 FBP21 的in vivo 前体mRNA 剪切实验  99-101
    3.2.10 反转录PCR (RT-PCR)  101
    3.2.11 FBP21 的in vitro 前体mRNA 剪切实验  101-102
    3.2.12 免疫荧光定位和激光共聚焦实验  102-103
  3.3 实验结果和讨论  103-121
    3.3.1 FBP21 和SIPP1 的重组质粒  103-104
    3.3.2 FBP21 和SIPP1 重组蛋白的表达和纯化  104-105
    3.3.3 FBP21 和SIPP1 的in vitro 相互作用  105-106
    3.3.4 FBP21 和SIPP1 的in vivo 相互作用  106-109
    3.3.5 FBP21 在细胞内的定位  109-113
    3.3.6 FBP21 及其双WW 结构域在前体mRNA 剪切中的功能  113-121
  3.4 总结  121-123
  参考文献  123-126
英文缩写词表  126-127
致谢  127-129
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  129-131

剪切因子FBP21双WW结构域的溶液结构和生物学功能研究

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