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白芍总苷对胶原诱导小鼠关节炎作用的基础研究

作　者: 刘锋
导　师: 毕黎琦
学　校: 吉林大学
专　业: 内科学
关键词: Rheumatoid arthritis Total glucosides of paeony Collagen induced arthritis Apoptosis
分类号: R593.22
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是累及多个关节的慢性进行性炎症性疾病,其特征表现是T淋巴细胞及B淋巴细胞的浸润,滑膜组织的过度生长,进而引起的关节软骨及骨进行性破坏。尽管一致公认RA的发病与免疫系统密切相关,而且许多研究也证实T细胞、B细胞、巨噬细胞、滑膜细胞和许多的炎症因子例如肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα, TNFα)、白介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)、CD40在介导组织损伤及保持慢性炎症反应中都起到了重要作用,但是RA的发生、迁延以及与上述因子的确切关系仍不是十分清楚。亦由于上述因素,RA很难得到有效治疗。因此以鼠为代表的类风湿关节炎动物模型为研究RA的发病机制及药物治疗提供了实质性观察的可能性。白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是一种新近研究出来的多苷类的治疗风湿免疫疾病的传统中药。具有双向免疫调节作用,即较大剂量时可以抑制机体免疫功能,并且还具有保护肝脏功能的作用,从而最大限度的减少了药物的毒副反应。但鲜见有其对RA治疗机理的深入报告。我们经查阅文献,尚未见关于TGP对细胞周期影响的报道。微小PRNA(microRNA, miRNA)是一类分子量为22个核苷酸左右的内源性非编码RNA,是细胞发育、凋亡和代谢等多种维持生命必须的生物学功能调节因子。目前尚未见TGP对于RA患者1niRNA影响的报道。因此,本实验采用CIA模型,从TGP对CIA鼠免疫细胞和滑膜细胞凋亡及凋亡调节蛋白的影响,对炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的影响,对骨髓细胞细胞周期影响,对滑膜细胞miR-15a表达的影响等多方面全面而系统的探讨了TGP对RA的治疗机制。目的：建立小鼠CIA模型,测定抗CII抗体水平,探讨CII抗体诱导小鼠关节炎的机制；观察TGP对CIA鼠关节局部肿胀及病理形态改变的影响,明确TGP对CIA鼠的治疗作用；观察TGP对滑膜细胞凋亡形态学变化；检测TGP对CIA鼠免疫细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响,探讨TGP影响CIA鼠免疫功能的机制；检测TGP对血清TNF-α、IL-1、IL-6浓度的影响,探讨TGP抑制CIA鼠炎症反应机制；检测TGP对凋亡蛋白、凋亡调节蛋白及miR-15a的影响,探讨TGP诱导CIA鼠滑膜细胞凋亡的机制。方法：对DBA/1雄性鼠小鼠尾根部皮内注射100gg牛Ⅱ型胶原乳剂,制备CIA模型,体内试验中给予腹腔注射TGP (25、50、100mg·kg-1·d-1),测定TGP对淋巴细胞增殖影响的体外实验中,给予不同浓度的TGP (62.5mg/L、125mg/L、250mg/L)刺激。通过HE染色方法光镜下观察组织学改变；并在第二次免疫接种的第3周及第6周采用ELISA法检测对Ⅱ型胶原蛋白的抗体(抗CII抗体)进行测定；采用流式细胞仪检测骨髓细胞、淋巴细胞的凋亡率及骨髓细胞细胞周期的变化；应用共聚焦显微镜观察滑膜细胞凋亡的形态学改变；MTT法检测淋巴细胞增殖反应；放射性免疫测定法检测血清TNF-α、IL-1、IL-6的水平；实时定量RT-PCR检测miRNA-15a的表达情况；Western免疫印迹分析检测Bcl-2蛋白表达情况；免疫荧光染色方法检测Bc1-2蛋白及caspase 3表达情况。结果：1、CIA小鼠的临床特点、病理学分析及抗CII抗体水平实验结果显示在第二次免疫后,实验组的所有小鼠均出现了多发性关节炎,表现为前后肢多个关节处的红斑、肿胀及轮廓显示不清,出现关节炎症状的平均天数为12.25±9.498天,关节炎的平均评分为10.875±5.167分。病理组织学观察结果显示：在CIA评分高的小鼠关节的病理中,可见血管翳的形成及其与关节表面结合,进而侵蚀关节软骨和软骨下骨；在CIA评分为中度的小鼠病理中,可见局限性软骨细胞、骨细胞的破坏关节腔中均可见许多新生的小血管、毛细血管和单核细胞ELISA结果显示：所有CIA小鼠的高水平IgG在CII刺激下可持续稳定相对较长时间,且CIA小鼠关节炎的严重程度与抗CII IgG抗体效价呈正相关。2、TGP对CIA鼠继发性关节炎、关节病理的影响腹腔注射TGP14天后,我们观察到CIA鼠前后足的关节肿胀明显减轻；给药后的CIA鼠关节病理切片中侵润的中性粒细胞、淋巴细胞明显减少,滑膜组织增生减轻,毛细血管增生减少,血管翳形成受到抑制。3、TGP对CIA鼠免疫功能的影响流式细胞仪检测结果显示：经中、高剂量的TGP (50 100mg.kg-1.d-1)诱导后,骨髓细胞的凋亡率明显升高,达38.8%以上,脾脏细胞的凋亡率明显升高,达41.3%以上,胸腺B淋巴细胞的凋亡率明显升高,达36%以上,胸腺T淋巴细胞的凋亡率明显升高,达40.6%以上,上述各组与空白对照及CIA组比较,均具有显著性差异(P<0.01)。MTT结果显示给予不同浓度的TGP (62.5mg/L、125mg/L、250mg/L)刺激后脾脏各组T淋巴细胞及B淋巴细胞的增殖均受到抑制,与CIA组具有显著性差异(P<0.01)。骨髓细胞细胞周期的检测结果显示TGP中、高剂量(50、100mg.kg-1.d-1)给药组G0/G1期细胞比例明显升高,而S期细胞比例明显降低(P<0.05)。4、TGP对CIA鼠炎症反应的影响本实验结果显示：TGP低、中、高剂量组TNF-α、IL-1、IL-6的表达水平均低于CIA鼠(P<0.01),提示TGP在一定程度抑制了]PNF-α、IL-1、IL-6的表达；TNF-a、及IL-1的表达水平在高剂量与中剂量组无显著性差异(P>0.05)；高剂量组中IL-6的表达较中剂量组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)5、TGP对CIA鼠滑膜细胞凋亡的影响实时定量RT-PCR结果显示：与正常对照组相比,CIA鼠滑膜中miR-15a的表达下调(P<0.05)；给予TGP (50mg.kg-1.d-1)治疗后,TGP治疗组滑膜细胞miR-15a表达较CIA鼠组上调,差异均具有统计学意义(P<0.05); Western免疫印迹分析及免疫荧光结果均显示TGP治疗组Bcl-2蛋白表达较CIA鼠减低；免疫荧光结果还显示了TGP治疗组caspase 3表达较CIA鼠组增加。结论：(1)本实验成功地建立了胶原诱导的鼠类风湿关节炎的动物模型。Ⅱ型胶原蛋白抗体参与关节炎症的进展,其中炎症活动期可选择作为观察各项指标的敏感期。(2)TGP可以缓解CIA鼠关节炎症反应,减轻滑膜组织病变。(3)TGP能诱导CIA鼠骨髓、胸腺、脾脏等免疫器官内淋巴细胞凋亡,抑制淋巴细胞增殖,抑制骨髓细胞由相对静止期向增殖活跃期转化,抑制自身免疫反应。(4)TGP能诱导滑膜细胞凋亡并通过抑制CIA鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6的水平,抑制炎症反应。(5)CIA鼠滑膜细胞miR-15a的表达较正常对照组下调。(6)TGP治疗后,CIA鼠滑膜细胞Bcl-2蛋白的表达显著减少,miR-15a及caspase 3表达增加,提示TGP可能通过增加]niR-15a的表达诱导滑膜细胞凋亡,这为研究TGP治疗类风湿关节炎的机制提供了新思路。

全文目录

前言  4-6
摘要  6-9
Abstract  9-16
英文缩略词表  16-17
第1章文献综述  17-38
  1.1 CIA模型的选择及建立  17-21
    1.1.1 选择Ⅱ胶原蛋白建立动物模型的依据  17-18
    1.1.2 CIA模型的评价  18-19
    1.1.3 CIA的发病机制  19
    1.1.4 CIA模型的特点  19-21
  1.2 细胞凋亡机制障碍与类风湿关节炎病因学研究  21-26
  1.3 微小RNA在类风湿关节炎中的研究进展  26-38
    1.3.1 miRNA的调节免疫作用  26-27
    1.3.2 miRNA与类风湿关节炎  27-30
    1.3.3 展望  30-38
第2章 CIA模型的建立及相关抗体的诱导的机制  38-50
  2.1 引言  38
  2.2 实验材料  38-39
    2.2.1 主要试剂  38-39
    2.2.2 主要仪器  39
    2.2.3 实验动物的来源  39
  2.3 实验方法  39-43
    2.3.1 实验分组及模型的制备  39-40
    2.3.2 鼠的个体认定  40-41
    2.3.3 检测项目  41-43
    2.3.4 统计学方法  43
  2.4 实验结果  43-47
    2.4.1 CIA小鼠的临床特点  43-44
    2.4.2 病理学分析  44-46
    2.4.3 测定抗CII抗体水平  46
    2.4.4 CIA关节炎的严重程度与抗CII的IgG抗体效价间的关系  46-47
  2.5 讨论  47-50
第3章白芍总苷诱导CIA鼠免疫细胞和滑膜细胞凋亡及相关细胞因子和蛋白表达的研究  50-78
  3.1 引言  50
  3.2 实验材料及方法  50-54
    3.2.1 实验分组  50
    3.2.2 给药方案  50
    3.2.3 实验试剂及实验仪器  50-51
    3.2.4 实验方案及步骤  51-54
  3.3 实验结果  54-74
    3.3.1 组织形态的改变  54-55
    3.3.2 细胞凋亡的检测结果  55-67
    3.3.3 脾脏淋巴细胞的增殖反应  67-69
    3.3.4 TGP对小鼠骨髓细胞细胞周期的影响  69-72
    3.3.5 相关细胞因子在各组中的表达  72-74
  3.4 讨论  74-78
    3.4.1 TGP对CIA鼠关节的治疗作用  74-75
    3.4.2 TGP对CIA鼠淋巴细胞凋亡及增殖反应的影响  75
    3.4.3 TGP对CIA鼠骨髓细胞细胞周期的影响  75-76
    3.4.4 TGP对CIA鼠相关细胞因子表达的影响  76-78
第4章白芍总苷对CIA鼠滑膜细胞MIR-15A及BCL-2、CASPASE3表达的影响  78-88
  4.1 前言  78
  4.2 实验材料  78-80
    4.2.1 主要仪器  78-79
    4.2.2 主要试剂  79-80
  4.3 实验方法  80-83
    4.3.1 分组及给药  80
    4.3.2 实时定量RT-PCR检测miR-15a含量  80-81
    4.3.3 Bc1-2蛋白水平检测——Western免疫印迹分析  81-83
    4.3.4 bc1-2、caspase 3蛋白水平检测—免疫荧光染色  83
    4.3.5 统计学方法  83
  4.4 实验结果  83-86
    4.4.1 CIA鼠滑膜中miR-15a的表达下调,Bc1-2表达上调  83
    4.4.2 TGP治疗组miR-15a表达上调,Bc1-2表达下调  83-85
    4.4.3 TGP治疗组caspase 3表达增加  85-86
  4.5 讨论  86-88
    4.5.1 TGP与类风湿关节炎滑膜细胞凋亡  86-87
    4.5.2 miR-15a与细胞凋亡  87
    4.5.3 TGP及miR-15a与滑膜细胞凋亡  87-88
第5章结论  88-89
参考文献  89-93
作者简介及在学期间所取得的科研成果  93-94
致谢  94

白芍总苷对胶原诱导小鼠关节炎作用的基础研究

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