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Matrilin-1在小鼠胫骨闭合骨折模型愈合过程中的作用研究

作 者: 李鑫
导 师: 高忠礼;陈迁
学 校: 吉林大学
专 业: 外科学
关键词: Matrilin-1 骨折愈合 血管生成 成骨 血管内皮生成因子 荧光分子体层摄影 微CT 生物力学分析
分类号: R683.42
类 型: 博士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


背景目前,每年有数以万计的人由于各种原因发生骨折,尽管其中大部分病人经过治疗获得痊愈,但是仍有5-10%病人无法完全康复,饱受骨折不愈合或骨折延迟愈合带来的痛苦[1]。骨折愈合障碍会导致病人运动功能缺失,因此深入研究骨折愈合的病理生物学机理,可以为我们开发促进骨折愈合的生物学及临床治疗方法奠定基础。骨折愈合是十分复杂的生物修复过程,包含细胞内外环境的成骨分子信号调控,其分子生物学机制目前仍不明确。这个过程中,在胚胎发育期调控骨骼生长的分子生物学机制在骨折愈合过程中再次起作用[2]。除了分子生物学影响因素,骨折愈合过程还受力学因素影响。如果骨折端获得足够稳定的固定,骨折愈合过程将以直接愈合方式进行;相反,如果骨折端有微动,骨折愈合过程将以间接愈合方式进行。实际上大部分骨折都以间接骨折愈合方式进行。这种骨折愈合方式所经历的是软骨内成骨过程,即未分化的基质细胞先聚集在骨折部位,经过增生和分化过程形成软骨,而后再骨化最终由骨取而代之的过程。多种细胞外基质蛋白在间接骨折愈合过程中发挥作用,Matrilin-1(MATN1)便是其中之一。MATN1是一种软骨特异性细胞外基质蛋白,在软骨内成骨过程中的软骨化骨阶段有重要作用。现有研究证实MATN1与Ⅱ型胶原纤维和蛋白多糖结构关系密切,并且能够在软骨内部形成软骨依赖性和非依赖性纤维网结构[3] [4]。但是,其在动物体内的生物学作用还尚未明确。既然间接骨折愈合与软骨密切相关,且MATN1又与软骨关系密切,由此我们假设MATN1会在骨折愈合过程产生一定作用。方法基因敲除小鼠是一种经过基因工程技术处理过的小鼠,通过对基因的靶向突变使一个或几个基因失去功能。目前,基因敲除小鼠已成为研究基因功能的重要动物模型。本实验使用了MATN1敲除鼠(MATN1-/-)和野生型鼠(Wild Type, WT)研究MATN1在小鼠骨折愈合过程中的作用。我们使用了经典的小鼠胫骨闭合骨折髓内针固定模型,该模型具有制作过程简便,感染率低,对设备要求低的特点。在实验中我们使用了如下方法评价骨折愈合情况:使用X线影像技术观察骨折愈合过程;使用荧光分子断层体内成像技术(FMT)对骨折部位血供情况和成骨情况进行定量分析分析;微CT技术和生物力学扭力测试用于评价骨痂情况;组织学Safranin-O/Fast-green染色能清楚地显示骨痂内软骨细胞情况;实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR)定量分析骨痂内血管生成标记物和成骨标记物目的基因表达水平。其中值得加以简略介绍的是如下三种技术方法:FMT技术平台能够对实验小动物的全身组织,包括深层组织进行无创伤性地分子生物学水平信息分析。目前在美国,该系统平台已成功应用于研究肿瘤,炎症,肺脏疾病,心血管疾病和骨骼疾病。通过使用该平台,研究人员能够实时监控并定量分析生物学标记物和信号通路变化,为进一步深刻理解疾病机制和明确治疗效果提供有力帮助。本实验是FMT系统平台第一次用于研究骨折愈合过程。微CT能够对小鼠细小的骨痂内部成分进行定量分析,精确计算骨痂内骨量(BV)和骨痂整体体积(TV)。生物力学扭力测试目前已被认为是评价骨折愈合情况的金标准。该平台通过测定能够使骨痂断裂的最大扭矩和刚度,来评价骨折愈合的生物学功能情况。结果实验中,我们观察到MATN1-/-小鼠较WT小鼠骨折愈合快。X线影像和组织学染色观察结果显示MATN1-/-小鼠较WT小鼠愈合快,骨痂成骨增高。Safranin-O/Fast-green染色分析,发现MATN1-/-小鼠组较WT小鼠组提前进入骨化阶段。微CT结果显示MATN1-/-小鼠有更大的整体骨痂体积(TV)和骨体积(BV),但是两组的BV/TV值却相当。随后的生物力学扭力测试结果证实了MATN1-/-小鼠的骨痂与WT小鼠相比,能够承受更高的最大扭矩,有更优良的生物力学功能。在FMT系统平台上使用了血管生成荧光探针和成骨荧光探针实时跟踪评估分析两组骨折愈合过程中血管生成情况和成骨情况。我们得到的结果为,MATN1-/-小鼠较WT小鼠有更多的血管和骨生成,且实验结果完全符合已知的骨折愈合过程中血管和新骨生成随时间的变化之间的关系。Real time PCR分析结果显示MATN1-/-小鼠较WT小鼠,在骨折后第14天和第21天,血管发生相关基因,如血管内皮生长因子(VEGF)和成骨相关基因水平,如骨形态发生蛋白(BMP),都分别明显高于后者。除此之外,MATN1-/-小鼠骨痂内的基质细胞衍生因子(SDF-1)基因水平也明显高于WT小鼠。综合上述实验结果,我们第一次证实了MATN1在体内的作用,即MATN1对小鼠骨折愈合过程起负向调节作用。MATN1抑制骨折愈合的分子生物学机制目前尚不清楚。但是,我们认为可能是如下原因造成了这种现象:第一,MATN1抑制新血管生成的作用。骨折部位的血供对骨折愈合至关重要。第二, MATN1可能是通过抑制SDF-1的作用来负向调节骨折愈合的。SDF-1已经被证实有促进成骨的作用,并且能够通过促进造血干细胞、基质干细胞和其他炎症细胞在损伤部位聚集。所以,SDF-1功能受到抑制时,骨折愈合过程势必会受到影响。本实验首次明确了MATN1在体内的生理学作用,MATN1这个软骨特异性基质分子,可能通过抑制血管生成和骨生成,造成骨折愈合延迟。未来仍需要大量研究工作以阐明MATN1在骨折愈合过程中的作用机制。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-12
第1章 引言  12-14
第2章 综述  14-36
  综述1 骨折愈合过程中的分子生物学机制  14-28
  综述2 鼠类骨折愈合与骨再生研究模型的研究进展  28-36
第3章 材料和方法  36-44
  3.1 实验材料  36-37
    3.1.1 实验动物  36
    3.1.2 药品和试剂  36
    3.1.3 重要实验仪器  36-37
  3.2 实验方法  37-43
    3.2.1 小鼠骨折模型  37-38
    3.2.2 组织学染色分析  38
    3.2.3 荧光分子断层影像分析血管生成和骨生成  38-39
    3.2.4 微CT 分析骨痂  39
    3.2.5 生物力学分析  39-40
    3.2.6 骨痂内目的基因mRNA 表达测定(RT-PCR 法)  40-43
  3.3 统计学方法  43-44
第4章 实验结果  44-70
  4.1 MATN1 在放射线影像学水平对小鼠骨折愈合的影响  44-45
  4.2 MATN1 在组织形态学水平对小鼠骨折愈合的影响  45-46
  4.3 MATN1 对小鼠骨折愈合晚期骨痂成分的影响  46-47
  4.4 MATN1 对小鼠骨折愈合晚期骨痂的力学性质的影响  47-49
  4.5 MATN1 对小鼠骨折愈合分子水平的影响  49-70
第5章 结论  70-76
参考文献  76-96
附图  96-100
作者简介及在学期间所取得的科研成果  100-102
致谢  102

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 骨科学(运动系疾病、矫形外科学) > 骨折、骨的损伤 > 四肢骨折 > 下肢骨折
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