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PARP-1抑制剂对人肺癌A549、calu-6细胞系放射增敏作用的研究

作 者: 曹玲
导 师: 王平
学 校: 天津医科大学
专 业: 肿瘤学
关键词: PARP-1 抑制剂 ABT-888 放射增敏 放射治疗
分类号: R965
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


目的:多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)是一种广泛存在于细胞内的一种具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用的聚合酶,在细胞DNA损伤后修复中发挥着至关重要的作用。放射治疗主要导致细胞DNA的损伤,而DNA损伤后的修复是导致放疗疗效降低的重要原因。本研究试图证实新型的PARP-1抑制剂ABT-888对人肺癌细胞的放疗增敏效果,并进一步探讨其产生机制。方法:以体外培养的人肺癌A549、Calu-6细胞系为研究对象。选择处于对数生长期的细胞,实验分组如下:空白对照组、单纯药物组、单纯放疗组、药物联合放疗组。噻唑蓝(MTT)比色法分别检测ABT-888单药对两种细胞的增殖抑制作用,计算各自的IC10值,选择细胞毒性较低的IC10值作为后续实验的参考药物干预浓度。依据参考浓度,应用Western blot分别检测不同药物浓度下,PAR蛋白的表达变化,了解不同浓度的ABT-888对PARP-1活性的抑制作用。从而确认后续实验药物作用浓度及作用时间。采用克隆形成实验分别检测各组中两种细胞放疗增敏的作用并绘制细胞存活曲线,并计算放疗增敏比。流式细胞仪(FCM)检测各组的细胞周期分布变化情况。Western blot分别检测凋亡蛋白:Bcl-2、Bax; G2/M期关卡蛋白:P21以及细胞DNA修复蛋白:RAD51蛋白的表达情况。结果:1.MTT实验结果显示:A549细胞24小时、48小时及72小时的IC10值分别为(10.58±0.37)μmol/L、(8.15±0.15)μmol/L、(6.70±0.01)μmol/L。Calu-6细胞24小时、48小时及72小时的IC1o值分别为:(5.01±0.29)μmol/L、(4.06±0.57)μmol/L、(3.56±0.08)μmol/L。各组细胞在24小时、48小时及72小时的细胞生长抑制率并无明显差异(P值均>0.05)。而在相同的浓度及作用时间下,ABT-888对Calu-6细胞的作用比较明显(P值均<0.05)。故分别选取两种细胞的IC10为后续实验的药物参考浓度,A549为10μtmol/L, Calu-6为5μmol/L。因各组细胞在24小时、48小时及72小时的抑制率并无明显差异(P值均>0.05),所以选取24小时为后续的药物作用时间。2.根据MTT结果选取的药物实验浓度梯度为:0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L及8μmol/L。Western bolt结果表明:两种细胞均存在PAR的表达,且表达水平存在着差异。随着PARP-1抑制剂ABT-888的浓度的增高,PAR的表达也受到抑制,即推测PARP-1的活性也受到于制。且A549细胞在8μmol/L而Calu-6细胞在2μmol/L PAR表达已受明显抑制。因两浓度均在各自IC10以下,细胞毒性低而抑制PARP-1活性明显,故选为后续实验浓度。3.克隆形成实验结果显示:A549细胞实验组中,药物联合放疗组的SER为1.50,Calu-6细胞实验组中,药物联合放疗组的SER为1.88。ABT-888明显增加了两组不同细胞的放射敏感性,且calu-6细胞的增敏效果更为明显。4.细胞周期结果显示:对于A549细胞,单纯ABT-888可以使其阻滞在G2/M期,单独放射线照射也可以使得G2/M期细胞比例增加,但作用均不明显(P>0.05)。药物与放射线联合作用后,细胞G2/M期阻滞尤其明显(P<0.05)。而对于Calu-6细胞,也看到了类似的现象,而且联合效果较A549细胞更加明显。5. Western blot检测结果:两组细胞系均显示出药物联合放疗后凋亡相关蛋白:促进凋亡Bax蛋白表达最高,抑制凋亡Bcl-2蛋白表达最低。而G2/M期关卡蛋白P21也在药物联合放疗组中表达最高。观察DNA修复蛋白RAD51并未发现改变。出此可知,药物联合放疗后增加G2/M期阻滞;增加细胞凋亡,且并未下调DNA修复蛋白RAD51的表达。结论:PARP-1抑制剂ABT-888有明显的放疗增敏作用,有望成为低毒高效的放疗增敏剂。而其放疗增敏机制可能与增加细胞G2/M期阻滞及抑制DNA修复诱发细胞凋亡有关。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略语/符号说明  9-10
前言  10-12
  研究现状、成果  10-11
  研究目的、方法  11-12
对象和方法  12-27
结果  27-37
讨论  37-41
结论  41-42
参考文献  42-45
发表论文和参加科研情况说明  45-46
综述 PARP-1一个肿瘤治疗的新靶点  46-58
  综述参考文献  54-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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