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miR-20调控人骨髓来源的间充质干细胞成骨分化及机理研究

作　者: 张锦芳
导　师: 孔祥復
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 间充质干细胞 miRNA-20a 成骨分化 PPARγ BMP信号通路
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)是一种具有多向分化能力的干细胞,在一些分化因子的调控下能分化成多种细胞,如成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞等。所以,MSCs作为成骨细胞的前体细胞,对于骨的形成和重建具有重要的意义。microRNA(miRNA)是由20 ~ 24个核苷酸组成的非编码小RNA,可以通过与靶标基因mRNA 3’-UTR上的靶点结合,介导mRNA降解或抑制mRNA转录后水平的表达,从而导致靶标蛋白表达的下降。近十年来的研究发现miRNA在胚胎发育及细胞的增殖、分化和凋亡等多种生命活动中发挥着重要作用。但是,miRNA是否调控MSCs成骨分化的命运却一直未见报道。我们在研究中发现,miR-17-5p家族,尤其是miR-20a,能决定人MSCs成骨分化的命运和调控成骨分化的过程。miR-20a mimics的过表达能促进Runx2和BMPs在转录和翻译水平的表达升高,从而激活BMP信号通路。我们通过软件预测和分析,发现PPARγ是miR-20a的一个靶标基因。miR-20a能通过抑制PPARγ表达来上调Runx2和BMPs的表达,从而破坏成脂分化与成骨分化的动态平衡,决定MSCs成骨分化的命运。软件的预测还提示BAMBI和CRIM1也是它的靶标基因。其中BAMBI是BMP的一个假受体,与真受体竞争性的与BMP蛋白结合,从而拮抗BMP信号通路。而CRIM1是BMP信号通路的抑制子,能阻断BMP蛋白的成熟和向细胞膜的转移。所以,miR-20a通过抑制这两个基因的表达从而上调了BMP信号通路,而BMP信号的激活又加速了成骨分化。总之,本论文研究发现miR-20a通过调控靶标基因PPARγ的表达决定了MSCs成骨分化的命运,又通过对另外两个靶标基因BAMBI和CRIM1的表达抑制从而上调了BMP/Runx2信号通路。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章前言  10-36
  1.1 间充质干细胞(MSC)成骨分化研究进展  10-24
    1.1.1 MSCs 简介  10
    1.1.2 MSCs 成骨分化的研究意义  10-11
    1.1.3 MSCs 成骨分化的模型及过程  11-12
    1.1.4 成骨分化的主要转录调控因子  12-19
      1.1.4.1 Runx2/Cbfa1  13-15
      1.1.4.2 PPAR_γ  15-16
      1.1.4.3 Osx  16-17
      1.1.4.4 Sox  17-18
      1.1.4.5 其它  18-19
    1.1.5 成骨分化过程中主要信号通路的研究  19-24
      1.1.5.1 BMP/TGF-β信号通路  19-22
      1.1.5.2 Wnt 信号通路  22-24
  1.2 miRNA 的研究进展  24-34
    1.2.1 miRNA 简介  24
    1.2.2 miRNA 的生物合成  24-25
    1.2.3 miRNA 对转录后水平的调控  25-28
      1.2.3.1 mRNA 降解  25-26
      1.2.3.2 阻断翻译起始  26
      1.2.3.3 加工小体的移位  26-27
      1.2.3.4 翻译的激活  27-28
    1.2.4 miRNA 在调控细胞分化和发育中的功能  28-32
      1.2.4.1 早期胚胎发育中的功能  29-30
      1.2.4.2 神经分化中的功能  30
      1.2.4.3 肌肉分化中的功能  30-31
      1.2.4.4 淋巴细胞分化中的功能  31
      1.2.4.5 成骨和成脂分化中的功能  31-32
    1.2.5 miRNA-17-5p 家族及其功能的研究  32-34
      1.2.5.1 miR-17-5p 家族的组成  32-33
      1.2.5.2 miR-17-5p 家族的功能研究  33-34
  1.3 本论文研究的目的和意义  34-36
第2章材料和方法  36-46
  2.1 实验试剂及材料  36-37
  2.2 实验仪器设备  37
  2.3 实验方法  37-46
    2.3.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养  37
    2.3.2 BM-MSCs 表面抗原的鉴定  37-38
    2.3.3 BM-MSCs 的成骨与成脂分化  38
    2.3.4 瞬时转染与转染效率的测定  38-39
    2.3.5 碱性磷酸酶(AKP)活性的检测  39
    2.3.6 碱性磷酸酶(AKP)的染色  39
    2.3.7 茜素红(ARS)染色  39
    2.3.8 Von Kossa 染色  39-40
    2.3.9 油红O 染色  40
    2.3.10 半定量RT-PCR  40-41
    2.3.11 Q-PCR 测定miRNA 含量  41
    2.3.12 荧光素酶报告质粒的构建  41-43
    2.3.13 蛋白质的免疫印记(western blot)  43-44
    2.3.14 ELISA 检测BMP2, BMP4 和Runx2 的分泌与表达  44
    2.3.15 无胸腺裸鼠的异位成骨  44
    2.3.16 miR-20a 慢病毒表达载体的构建及病毒包装  44-45
    2.3.17 统计分析  45-46
第3章人骨髓来源的MSCs 的分离和鉴定  46-50
  3.1 MSCs 的形态学观察  46-47
  3.2 MSC 细胞表面抗原的鉴定  47
  3.3 讨论  47-50
第4章 miR-20a 促进人骨髓来源的MSCs 的成骨分化  50-64
  4.1 MSCs 在成骨分化的过程中表达miR-17-5p 家族  50-51
  4.2 miR-17-5p 家族具有促进成骨分化的潜能  51-53
  4.3 miR-20a，miR-206 及miR-17 在成骨分化中的表达模式  53-55
  4.4 miR-20a 促进MSCs 的成骨分化  55-61
    4.4.1 AKP 活性的测定  55-57
    4.4.2 AKP 染色  57
    4.4.3 茜素红和Von Kossa 染色  57-59
    4.4.4 标志基因的测定  59
    4.4.5 miR-20a 病毒质粒促进 MSCs 的成骨分化  59-61
  4.5 讨论  61-64
第5章 miR-20a 促进MSCs 成骨分化机制的研究  64-85
  5.1 miR-20a 通过上调BMP 信号通路  64-67
  5.2 miR-20a 通过与靶标基因PPAR_γ配对来调控成骨分化  67-72
    5.2.1 miR-20a 引起成骨和成脂分化中 PPAR_γ在m RNA 水平和蛋白水平表达的变化  67-69
    5.2.2 miR-20a 抑制了PPAR_γm RNA 的3’UTR 荧光酶活性  69-70
    5.2.3 PPAR_γ的SiRNA 促进MSCs 的成骨分化及BMPs 的表达  70-72
  5.3 miR-20a 通过target BAMBI 和CRIM1 来调控成骨分化  72-80
    5.3.1 BAMBI 和CRIM1 在成骨分化中的表达模式  72-73
    5.3.2 miR-20a 诱导的成骨分化中BAMBI 和CRIM1 表达变化  73-74
    5.3.3 miR-20a 抑制BAMBI 和Crim1m RNA 的3’UTR 荧光酶活性  74-78
    5.3.4 BAMBI、CRIM1 的SiRNA 促进MSCs 的成骨分化及BMPs 的表达  78-80
  5.4 miR-20a 促进成骨分化的作用机理的总结  80
  5.5 miR-20a 对成脂分化的影响  80-82
  5.6 讨论  82-85
第6章 miR-20a 的异位成骨  85-90
  6.1 异位成骨最佳时间的确定  85-86
  6.2 异位成骨的X-光片结果  86-87
  6.3 异位成骨的组织染色  87-88
  6.4 讨论  88-90
第7章结论  90-92
参考文献  92-110
致谢  110-111
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  111-112

miR-20调控人骨髓来源的间充质干细胞成骨分化及机理研究

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