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抑制Ppif基因的表达减轻肾缺血再灌注损伤的实验研究

作　者: 胡威
导　师: 叶章群；陈志强
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 凋亡 线粒体通透性转换孔 慢病毒载体 转移质粒 缺血再灌注损伤 大鼠肾细胞 小干扰RNA Ppif基因
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：建立稳定的体外正常大鼠肾细胞(NRK cells)缺血再灌注模型,寻找建立模型的最佳条件,并验证大鼠Ppif基因在缺血再灌注模型中的表达；研究siRNA对大鼠Ppif基因的抑制作用；构建pGCL-Ppif即介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装pGCL-Ppif慢病毒载体奠定基础；观察抑制大鼠Ppif基因的表达对缺血再灌注损伤肾脏的保护作用,并探讨其作用机制。方法：(1)体外培养正常大鼠肾细胞(NRK cells),以氧糖剥夺(krebs)液及使用去氧剂连二亚硫酸钠(Na2S204)来模拟体外正常大鼠肾细胞(NRK cells)缺血再灌注,Annexin V/PI染色后,流式细胞仪检测正常大鼠肾细胞(NRK cells)凋亡率,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ppif基因(CypD的编码基因)的mRNA表达。(2)根据大鼠Ppif基因序列设计并化学合成3对siRNA及1对阴性对照siRNA,并在5’端标记FAM羧基荧光素,以脂质体Lipofectamine 2000转染入正常大鼠肾细胞(NRK cells),用RT-PCR和Westernblot分别检测其在正常大鼠肾细胞(NRK cells)中的Ppif基因和蛋白表达量的改变、验证所设计的siRNA的抑制效应。(3)以大鼠Ppif基因为靶基因,根据核糖核酸干扰(ribonucleic acid interfere, RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的pGCL-Ppif即重组慢病毒载体转移质粒并对该基因的质粒进行测序鉴定及PCR鉴定。(4)建立SD大鼠肾缺血再灌注模型,将实验动物随机分为3组：空白组、阴性对照组、治疗组(各20只)。治疗组大鼠给Ppif基因靶向核糖核酸干扰(ribonucleic acid interfere, RNAi)慢病毒载体(4 ug/g)0.3 mL,阴性对照组再灌注时给予0.3 mL含体积分数0.01DMSO的生理盐水,空白组不夹闭肾蒂,余处理同阴性对照组。分别检测各组血肌酐(Cr)含量、细胞凋亡指数(AI)、尿素氮(BUN)含量、HE染色组织病理学分析。结果：(1)去氧去糖40 mmin再复氧复糖后,正常大鼠肾细胞(NRK cells)凋亡率于16h达到最高值(P<0.05)。Ppif mRNA在再复氧0 h时,Ppif mRNA有基础水平的表达,4 h开始升高,8 h时表达水平明显升高,随再灌注时间延长,表达量逐渐增高,再灌注16 h时达高峰,48 h开始回落,各时段与0 h比较,均有统计学意义(P<0.05)；(2)以脂质体Lipofectamine 2000转染所设计的siRNA进入正常大鼠肾细胞(NRK cells),转染效率>90%。起始于405、556位点的siRNA在正常大鼠肾细胞(NRK cells)基因水平对Ppif无明显抑制效应(P>0.05)；起始于198位点的siRNA正常大鼠肾细胞(NRK cells)在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75.25%(P<0.05)；蛋白水平下降72.13%P<0.05)；(3)Ppif的短发夹RNA (small hairpin ribonucleic acid,shRNA)片段被成功克隆到pGCL-GFP慢病毒载体转移质粒中,并且4个插入的序列与我们之前设计的靶基因片段是一致的；(4)治疗组与阴性对照组比较,血BUN和Cr均明显降低,细胞凋亡指数(AI)明显下降,且有显著性差异(P<0.05),HE染色组织病理学分析结果显著。结论：(1)本模型可以模拟正常大鼠肾细胞(NRK cells)体内缺血再灌注机制,去氧去糖40 min后再复氧复糖16 h是体外正常大鼠肾细胞(NRK cells)缺血再灌注诱导凋亡的最佳条件,并验证了正常大鼠肾细胞(NRK cells)在缺氧再灌注模型中Ppif基因的表达。(2)起始于198位点的siRNA对正常大鼠肾细胞(NRK cells)的Ppif基因有明显的抑制效应。(3)成功的构建了慢病毒载体转移质粒,能够表达4个含Ppif靶基因片段,并且为进一步包装慢病毒载体(介导Ppif基因沉默)奠定了基础。(4)Ppif基因靶向RNAi慢病毒载体可以有效的抑制Ppif基因的表达,从而抑制线粒体的凋亡,减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-12
引言  12-14
第一部分 大鼠肾细胞缺血再灌注凋亡模型的建立及验证Ppif基因在模型中的表达  14-29
  摘要  14-15
  Abstract  15-16
  前言  16
  1 材料与药品  16
  2 实验方法  16-20
    2.1 细胞培养及体外缺血再灌注模型建立  16-18
    2.2 复制大鼠肾细胞体外缺血再灌注模型  18
    2.3 细胞形态学观察  18
    2.4 ANNECIN Ⅴ-FITC/PI荧光标记双染,流式细胞术检测细胞凋亡率  18-19
    2.5 RT-PCR法检测Ppif基因的mRNA水平  19-20
    2.6 统计学处理  20
  3 结果  20-22
    3.1 细胞形态特征变化  20-21
    3.2 细胞凋亡率检测  21
    3.3 RT-PCR法测定Ppif基因  21-22
  4. 讨论  22-23
  参考文献  23-24
  附图  24-29
第二部分 siRNA沉默Ppif基因表达对大鼠肾细胞增殖和凋亡的影响  29-46
  摘要  29-30
  Abstract  30-31
  前言  31
  1 材料与方法  31-37
    1.1 细胞株与主要试剂  31-32
    1.2 NRK细胞培养及NRK细胞缺氧再灌注模型的建立  32
    1.3 siRNA的设计与合成  32
    1.4 细胞培养和转染  32-33
    1.5 PpifmRNA表达的RT-PCR检测  33
    1.6 Ppif表达蛋白(CypD)表达的Western blot检测  33-35
    1.7 MTT法检测细胞增殖活性  35-36
    1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡  36-37
    1.9 统计学处理  37
  2 结果  37-39
    2.1 siRNA转染细胞条件筛选及效率的评价  37
    2.2 转染后细胞形态的改变  37-38
    2.3 Ppif siRNA对NRK细胞Ppif mRNA表达的影响  38
    2.4 Ppif siRNA对NRK细胞Ppif蛋白表达的影响  38
    2.5 Ppif siRNA对NRK细胞增殖的影响  38-39
    2.6 Ppif siRNA对NRK细胞凋亡的影响  39
  3 讨论  39-41
  参考文献  41-43
  附图  43-46
第三部分 介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定  46-57
  摘要  46-47
  Abstract  47-48
  前言  48
  1 材料与方法  48-51
    1.1 材料  48-49
    1.2 靶向PPIF短发夹RNA(shRNA)的设计  49-50
    1.3 siRNA慢病毒表达载体转移质粒的构建及鉴定  50-51
  2 结果  51
    2.1 阳性克隆的PCR鉴定  51
    2.2 重组质粒的测序分析  51
    2.3 阳性克隆质粒抽提  51
  3 讨论  51-53
  参考文献  53-55
  附图  55-57
第四部分 抑制Ppif基因的表达对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用  57-68
  摘要  57-58
  Abstract  58-59
  前言  59
  1. 材料与方法  59-62
    1.1 试剂  59-60
    1.2 动物及分组  60
    1.3 实验方法  60-61
    1.4 肾相关功能检测指标及方法  61-62
    1.5 统计学处理  62
  2 结果  62-64
    2.1 慢病毒感染大鼠肾细胞感染效率观察  62-63
    2.2 Ppif基因靶向RNAi慢病毒载体抑制Ppif基因的表达,对I/R损伤肾脏功能的影响  63
    2.3 抑制Ppif基因的表达对I/R损伤肾脏细胞凋亡的影响  63
    2.4 大鼠肾组织病理学变化  63-64
  参考文献  64-66
  附图  66-68
PART Ⅴ Knockdown of Cyelophilin D gene by RNAi protects rat from ischemia/reperfusion-induced renal injury  68-84
  Abstract  68-69
  Introduetion  69-70
  Material and method  70-73
  Results  73-74
  Diseussion  74-75
  References  75-77
  附图  77-84
综述  84-93
  结语和展望  89-91
  参考文献  91-93
附录一 本课题发表文献  93

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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