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水稻OsELF3基因RNAi载体的构建及其转化研究

作　者: 赵俊茗
导　师: 李仕贵
学　校: 四川农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻 OsELF3基因抽穗期 RNAi 农杆菌介导转化
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水稻是人类赖以生存的粮食作物之一,其抽穗期是重要的农艺性状,决定品种种植的生态区和地区适应性,也是重要的育种目标,选育早熟高产的水稻品种一直为水稻育种家所重视。植物生育期调控是一个复杂的过程,涉及许多基因。ELF3基因是拟南芥昼夜节律钟的正向调节因子,在光感受器和中心振荡器之间起作用,并维持生理节律系的生存能力以便获得正确的振幅和周期。该基因的突变使得对光周期敏感性和节律调控作用丧失,在长日和短日条件下均表现为早花。在水稻中,通过蛋白质的在线比对发现,预测的OsELF3所编码的蛋白与拟南芥ELF3具有很强的序列相似。推测它具有调控水稻抽穗期的功能。RNA干涉(RNA interference, RNAi)技术作为一项新的生物学技术,能通过基因转录后的调控,抑制特定基因的表达,此方法的优点在于只改变目的基因,而不改变植物本身的遗传背景。作为一种简单的、有效的代替基因敲除的遗传工具。本研究成功构建水稻OsELF3基因RNAi表达载体pOsAct2-OsELF3-RNAi,以中花11、日本晴为受体,利用农杆菌介导的方法获得有价值的转基因植株。获得的RNAi材料为水稻OsELF3的深入研究奠定了基础。主要研究结果如下1根据Gramene上的OsELF3基因cDNA序列设计引物,分别进行PCR反应,扩增了约678bp大小的RNAi-Sence片段和RNAi-Antisence片段。2将OsELF3基因RNAi片段克隆到植物表达载体pOsAct2-I-nos上,得到RNAi表达载体pOsAct2-OsELF3-RNAi。受Actin2启动子调控,选择标记为潮霉素(Hpt)基因。3将构建好的RNAi表达载体pOsAct2-OsELF3-RNAi利用农杆菌介导的方法导入中花11、日本晴成熟胚诱导的胚性愈伤组织中,经组织培养,抗性筛选分化,获得再生植株。4利用离体叶片潮霉素快速鉴定、PCR扩增Hpt基因对转基因植株进行鉴定,证实了OsELF3基因RNAi片段正确插入到水稻基因组中,成功获得了12株阳性转基因水稻。5对OsELF3基因RNAi T,代阳性植株和对照中花11、日本晴的性状调查结果表明,OsELF3基因RNAi T1代相比中花11、日本晴抽穗期延迟,统计分析表明,差异显著。OsELF3基因的RNAi转基因水稻的获得为进一步研究OsELF3基因的功能提供了重要材料。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-27
  1 拟南芥开花的分子机理  12-16
    1.1 受光周期影响的途径  12-13
    1.2 春化途径  13-14
    1.3 GA途径  14
    1.4 自主调控开花途径  14-16
  2 水稻抽穗期基因研究现状  16-20
    2.1 水稻抽穗期的光温生态特性  16-17
      2.1.1 感光性  16
      2.1.2 感温性  16
      2.1.3 基本营养生长性  16-17
    2.2 抽穗期的遗传控制  17
    2.3 水稻抽穗期相关基因的克隆和功能研究  17-20
      2.3.1 Hd1  18
      2.3.2 Hd6  18
      2.3.3 Hd3a  18-19
      2.3.4 Ehd1  19
      2.3.5 Ghd7  19
      2.3.6 Se5  19-20
  3 RNAI技术的原理及应用  20-26
    3.1 RNAi的分子作用机理  21-23
    3.2 RNAi技术的应用  23-26
      3.2.1 高通量地研究基因功能  23
      3.2.2 基因治疗  23-24
      3.2.3 基因表达调控  24
      3.2.4 作物遗传改良  24-26
        3.2.4.1 RNAi技术在作物品质改良方面的应用  24-25
        3.2.4.2 RNAi技术在作物抗病虫方面的应用  25-26
  4 本论文研究的目的和意义  26-27
第二章材料与方法  27-42
  1 试验材料  27-29
    1.1 供试水稻品种  27
    1.2 菌株和载体  27
    1.3 主要试剂  27
    1.4 主要仪器设备  27-28
    1.5 培养基成分  28-29
      1.5.1 细菌培养基的配制  28
      1.5.2 适用于水稻的培养基  28-29
  2 试验方法  29-42
    2.1 水稻OsELF3基因RNAi表达载体的构建及检测  29-37
      2.1.1 水稻材料RNA的提取  29-30
      2.1.2 cDNA第一链的合成  30-31
      2.1.3 OsELF3基因干涉片段扩增  31-32
      2.1.4 PCR产物的纯化和回收  32
      2.1.5 水稻OsELF3基因干涉片段与克隆载体的连接  32
      2.1.6 大肠杆菌感受态的制备  32-33
      2.1.7 大肠杆菌转化  33
      2.1.8 阳性克隆的筛选和鉴定  33-34
      2.1.9 质粒的提取  34
      2.1.10 DNA测序及核苷酸序列分析  34
      2.1.11 OsELF3基因干涉中间载体构建  34-37
      2.1.12 干涉载体pOsAct2-OsELF3-RNAi的构建及检测  37
    2.2 农杆菌介导水稻OsELF3基因RNAi表达载体的转化  37-42
      2.2.3 农杆菌感受态的制备  37-38
      2.2.4 重组质粒对农杆菌的转化  38
      2.2.5 工程农杆菌的鉴定  38
      2.2.6 农杆菌介导的水稻遗传转化  38-39
        2.2.6.1 愈伤组织的诱导  38
        2.2.6.2 农杆菌菌株的活化  38-39
        2.2.6.3 共培养转化  39
        2.2.6.4 抗性愈伤组织筛选  39
        2.2.6.5 分化与生根  39
      2.2.7 转基因植株的分子生物学检测  39-41
        2.2.7.1 植物基因组DNA的提取  39-40
        2.2.7.2 转化植株的PCR检测  40-41
      2.2.8 转化植株叶片的潮霉素抗性鉴定  41
      2.2.9 抽穗期调查  41-42
第三章结果与分析  42-50
  1 水稻OsELF3基因RNAI载体的构建  42-44
    1.1 RNA提取和检测  42
    1.2 OsELF3基因干涉片段扩增  42-43
    1.3 Sence、Anti-Sence片段与pSK载体连接重组子的鉴定  43
    1.4 Sence、Anti-Sence片段插入pOsAct2-1-nos载体后BamHI和SalI双酶切鉴定  43-44
  2 农杆菌介导水稻OsELF3基因表达载体的转化  44-47
    2.1 转化农杆菌的鉴定  44-45
    2.2 转OsELF3基因RNAi表达载体水稻植株的获得  45-46
    2.3 T_0代转基因植株的PCR检测  46
    2.4 T_0代转化植株叶片的潮霉素抗性鉴定  46-47
  3 转基因植株后代T1的表型分析  47-50
    3.1 T_1代转基因植株的PCR检测  47-48
    3.2 T_1代转基因植株抽穗期调查  48-50
第四章讨论  50-53
  1 OsELF3基因RNAI表达载体的构建  50
  2 拟南芥生物节律钟基因ELF3与水稻基因OsELF3  50-51
  3 农杆菌介导水稻愈伤组织转化体系的优化  51-53
参考文献  53-59
致谢  59-60
附录1:一般培养基配方  60-61
附录2:AAM培养基配方  61

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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