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位点特异性重组系统在甘蓝型油菜中的建立

作 者: 王绍辉
导 师: 黄进勇
学 校: 郑州大学
专 业: 生物工程
关键词: 甘蓝型油菜 植物转基因 基因定点整合 位点特异性重组系统 Cre/loxP
分类号: S565.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 8次
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内容摘要


位点特异性重组技术是通过特异性重组酶对DNA特定序列进行准确切割和重新连接,从而在基因或染色体水平上对生物进行遗传改造的一种技术。位点特异性重组系统在转基因植物基因的定点整合、基因删除、多基因植物表达载体建立、多基因叠加、遗传育种等方面都有十分重要的意义。本实验选用Cre/loxP和FLP/FRT两个位点特异性重组系统,以GFP(绿色荧光蛋白)为报告基因成功构建了两个表达载体Z1与Cer40,用于在甘蓝型油菜中建立Cre/loxP及FLP/FRT两个位点特异性重组系统。在转基因成苗实验过程中,采用农杆菌浸染法转化植株,摸索了卡纳霉素抗性筛选的最佳浓度,以下胚轴和子叶柄为外植体的再生体系经过共培培养、延迟培养、筛选培养及生根培养等植物组织培养过程成功转化了12棵Z1载体阳性苗和3棵Cer40载体阳性苗。本实验还就实验过程中由于一些染菌和移栽失败,造成一些阳性苗濒临灭绝的问题摸索了一整套以叶片为外植体再生成苗的体系。并应用在了稀缺苗上,成功得到了大量再生苗,解决了此项问题。后期成苗检测研究过程中,用普通PCR方法在油菜基因组中检测到卡纳抗性基因,初步判断为转基因植株。通过以CRE酶基因为探针进行PCR-southern bolt杂交分析,分析结果显示有明显的预期信号出现,进一步表明表达载体已经整合到油菜染色体中。通过半定量法在RNA水平上检测到了Cre基因的表达,并得出了每个植株表达量的差异。这不仅证实了位点特异性重组系统成功的在甘蓝型油菜中表达,同时也为以后研究工作提供了有力依据。本实验成功在甘蓝型油菜中建立了Cre/loxP与FLP/FRT位点特异性重组系统,并进一步检测了阳性苗的表达情况,为在甘蓝型油菜中实现基因定点整合和多基因叠加等研究目标迈出了重要的一步。研究结果为后期实验提供了有力依据。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 综述  9-15
  1.1 我国油菜产业发展现状  9
  1.2 植物基因工程研究进展  9-12
    1.2.1 植物转基因方法  9-11
    1.2.2 植物转基因基本流程  11-12
    1.2.3 植物转基因发展现状  12
    1.2.4 植物转基因安全评价  12
  1.3 位点特异性重组系统在植物中的研究进展  12-15
    1.3.1 位点特异性重组系统的定义  13
    1.3.2 位点特异性重组系统的作用原理  13-14
    1.3.3 位点特异性重组系统在植物中的应用及研究意义  14-15
2 实验材料和方法  15-26
  2.1 实验材料  15
  2.2 试验方法  15-26
    2.2.1 载体构建方法策略  15-18
      2.2.1.1 Cre40载体具体构建策略  16
      2.2.1.2 Z1载体的构建  16-18
    2.2.2 目的基因导入甘蓝型汕菜  18-22
      2.2.2.1 农杆菌介导转化法的技术路线  19
      2.2.2.2 无菌苗的获得  19-20
      2.2.2.3 转基因菌株的活化  20
      2.2.2.4 浸染与共培培养  20
      2.2.2.5 延迟培养  20
      2.2.2.6 筛选培养  20-21
      2.2.2.7 生根培养  21
      2.2.2.8 扩繁培养  21
      2.2.2.9 移栽驯化  21-22
    2.2.3 成苗分子生物学检测  22-26
      2.2.3.1 普通PCR检测  22
      2.2.3.2 PCR-southern blot检测  22-24
      2.2.3.3 RNA水平检测表达量  24-26
3 结果与分析  26-33
  3.1 目的基因导入甘蓝型油菜结果  26-28
    3.1.1 无菌苗获得结果  26
    3.1.2 筛选压力确定结果  26-27
    3.1.3 筛选培养结果  27
    3.1.4 生根培养结果  27
    3.1.5 扩繁及移栽驯化结果  27-28
  3.2 转基因筛选成苗结果  28-29
  3.3 成苗分子生物学检测  29-33
    3.3.1 普通PCR检测  29
    3.3.2 PCR-southern blot检测  29-30
    3.3.3 半定量法检测RNA水平表达量  30-33
4 讨论  33-36
  4.1 载体构建  33
  4.2 甘蓝型汕菜农杆菌浸染转基因体系  33-34
  4.3 阳性苗检测  34-35
  4.4 实验未来发展与后期工作  35-36
参考文献  36-42
附录  42-50
致谢  50

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 油菜籽(芸薹)
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