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单增李斯特菌鸡卵黄抗体的抑菌性能及其机理研究

作　者: 隋建新
导　师: 林洪
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工及贮藏
关键词: 单增李斯特菌 鸡卵黄抗体 抑菌性能 亲和纯化 抑菌机理
分类号: TS201.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


单增李斯特菌是水产食品中最为常见的致病菌之一,其生长的温度范围广,在4℃的普通冷藏条件下能够缓慢生长繁殖,在动物养殖及鲜活产品储运过程中往往难以有效控制其污染和安全危害。卵黄抗体(IgY)作为禽类蛋黄中存在的唯一一种免疫球蛋白,不仅能与其抗原菌特异性的结合,而且结合后还能够抑制抗原菌的生长,是一种潜在的食品微生物抑菌剂。本研究以单增李斯特菌作为菌体抗原免疫蛋鸡制备IgY,并针对高纯度特异性IgY的制备纯化及其生物活性展开研究探讨,研究其对于水产品样本中单增李斯特菌的免疫亲和能力以及生长抑制效果,并对IgY的抑菌机理进行探讨,初步验证其应用于水产品加工储藏和分析检测的可行性,同时为水产品中其他致病菌和腐败菌的有效控制提供技术参考,论文的主要研究成果如下：以单增李斯特菌为抗原免疫产蛋母鸡,比较不同方法对于鸡卵黄中单增李斯特菌IgY的分离效果,研究IgY在鸡蛋中产生的免疫应答过程,分析确定所得IgY的主要理化性质。结果表明,采用硫酸铵盐析法可以取得较好的提取纯化效果,提取液中的IgY效价高且蛋白组分较为单一,IgY具有较好的理化稳定性,在pH 3～9范围内的抗体活性能够保持在70%以上,经60℃、4 h处理后免疫活性仍然良好。IgY对单增李斯特菌的生长有显著的抑制作用,在液体培养基中添加IgY,可有效抑制单增李斯特菌的生长,而且抗体浓度越大,抑菌效果越明显,培养基中添加200 mg/mL的IgY,37℃下孵育8小时,单增李斯特菌细胞数量减少90%,4℃下孵育120小时,单增李斯特菌细胞数量也可减少50%；固体培养基经200 mg/mL的1gY浸泡30分钟后,可使单增李斯特菌细胞数量减少80%以上；采用200 mg/mL的1gY处理过的新鲜三文鱼和烟熏三文鱼,真空包装后在6±1℃条件下储存15天,单增李斯特菌的细胞数量较空白对照可以降低两个对数单位,证实了1gY作为食品中致病菌抑制剂的可行性。通过对单增李斯特菌菌体细胞的预处理,建立了两种免疫亲和纯化方法对特异性IgY进行分离纯化,并对纯化后抗体的性能进行了研究。结果表明,两种方法均成功对特异性IgY和非特异性IgY进行了有效分离；相同浓度的IgY,纯化后抗体效价较纯化前提高了大约4,倍；在以新鲜牛奶为样本的抑菌实验中,50mg/mL的纯化后IgY的抑菌性能要比纯化前200 mg/mL IgY的抑菌性能高,纯化后的抑菌效率较纯化前提高4倍以上。对IgY的抑菌机理进行研究探讨,透射电镜观察发现,单增李斯特菌经200mg/mL IgY处理6小时后,菌体的细胞壁变薄,细胞的完整性被损坏,说明IgY通过对菌体细胞壁的破坏发挥抑菌性能；对IgY与单增李斯特菌相互作用后的反应液组分进行高效液相分离收集和核磁质谱结构分析,结果表明反应液中含有磷壁酸的结构组成单体,从分子水平上初步明确了IgY与菌体细胞的作用位点是细胞壁中的磷壁酸,为今后IgY抑菌效率的提高、IgY增效因子的研究以及各种增效因子的协同作用提供了理论支持。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
前言  14-34
  1 卵黄免疫球蛋白研究进展  14-21
    1.1 IgY的结构与性质  14-15
      1.1.1 IgY的结构  14-15
      1.1.2 IgY的性质  15
    1.2 IgY的提取分离与纯化  15-18
      1.2.1 IgY的提取分离  15-17
      1.2.2 IgY的纯化  17-18
    1.3 IgY的应用研究进展  18-21
      1.3.1 IgY在免疫检测中的应用  18-19
      1.3.2 IgY在动物疾病预防中的应用  19-20
      1.3.3 IgY在食品和医学中的应用  20-21
  2 单增李斯特菌的研究进展  21-26
    2.1 单增李斯特菌的生物学特性  21
    2.2 单增李斯特菌的流行性及致病性  21-22
    2.3 单增李斯特菌的检测与控制  22-26
      2.3.1 单增李斯特菌的检测  22
      2.3.2 单增李斯特菌的控制  22-26
  3 本研究的目的与意义  26
  参考文献  26-34
第一章 单增李斯特菌鸡卵黄抗体的制备及其理化性质研究  34-52
  1 引言  34
  2 实验材料  34-37
    2.1 实验菌株  34-35
    2.2 主要试剂  35
    2.3 主要仪器  35-36
    2.4 溶液体系  36-37
    2.5 实验动物  37
  3 实验方法  37-43
    3.1 菌体抗原的制备  37-38
    3.2 动物免疫  38
    3.3 IgY的提取  38-40
      3.3.1 硫酸铵盐析法  38-39
      3.3.2 硫酸钠盐析法  39
      3.3.3 冷冻乙醇沉淀法  39
      3.3.4 聚乙二醇沉淀法  39-40
    3.4 蛋白含量测定  40-41
    3.5 蛋白纯度测定  41
    3.6 间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定IgY效价  41-42
    3.7 IgY的免疫应答  42
    3.8 IgY理化性质的研究  42
      3.8.1 IgY的酸碱稳定性  42
      3.8.2 IgY的热稳定性  42
    3.9 数据分析  42-43
  4 实验结果与分析  43-49
    4.1 不同提取方法对于IgY提取效果的比较  43-45
    4.2 蛋鸡免疫过程中特异性IgY效价的动态变化  45-47
    4.3 IgY的理化稳定性  47-49
  5 本章小结  49
  参考文献  49-52
第二章 单增李斯特菌卵黄抗体抑菌性能的研究  52-65
  1 引言  52
  2 实验材料  52-53
    2.1 实验菌株  52
    2.2 主要试剂  52-53
    2.3 主要仪器  53
    2.4 实验样品  53
  3 实验方法  53-55
    3.1 液体培养条件下IgY的抑菌性能  53-54
    3.2 固体培养条件下IgY的抑菌性能  54
    3.3 水产样品低温冷藏下IgY的抑菌性能  54
    3.4 数据分析  54-55
  4 结果与讨论  55-62
    4.1 液体培养条件下IgY的抑菌效果  55-57
    4.2 固体培养条件下IgY的抑菌效果  57-58
    4.3 冷藏条件下IgY对水产食品中单增李斯特菌的抑制效果  58-62
  5 本章小结  62
  参考文献  62-65
第三章 单增李斯特菌特异性卵黄抗体的纯化  65-84
  1 引言  65-67
  2 实验材料  67-68
    2.1 实验菌株  67
    2.2 主要试剂  67
    2.3 主要仪器  67-68
  3 实验方法  68-72
    A 3.1 单增李斯特菌菌体的氨基活化  68
    A 3.2 氨基含量的测定  68-69
    A 3.3 免疫亲和层析柱的制备  69
    A 3.4 特异性IgY的亲和纯化  69
    A 3.5 特异性IgY纯化效果的测定  69-70
    A 3.6 数据分析  70
    B 3.1 单增李斯特菌菌体细胞的预处理  70
    B 3.2 单增李斯特菌菌体细胞对特异性IgY的结合能力  70
    B 3.3 特异性IgY的分离纯化  70-71
    B 3.4 特异性IgY纯化效果的测定  71
    B 3.5 特异性IgY抑菌效果的测定  71
    B 3.6 数据分析  71-72
  4 结果与讨论  72-81
    A 4.1 单增李斯特菌菌体细胞的氨基活化  72-73
    A 4.2 免疫亲和层析柱的制备  73
    A 4.3 特异性IgY的纯化  73-75
    A 4.4 IgY纯化效果  75-77
    B 4.1 单增李斯特菌菌体细胞的预处理  77
    B 4.2 单增李斯特菌菌体细胞对特异性IgY的结合能力  77-78
    B 4.3 特异性IgY的分离纯化  78-79
    B 4.4 特异性IgY纯化效果的测定  79-80
    B 4.5 特异性IgY抑菌效果的测定  80-81
  5 本章小结  81-82
  参考文献  82-84
第四章 单增李斯特菌卵黄抗体抑菌机理的研究  84-106
  1 引言  84-85
  2 实验材料  85-86
    2.1 实验菌株  85
    2.2 主要试剂  85
    2.3 主要仪器  85-86
  3 实验方法  86-89
    3.1 IgY对单增李斯特菌细胞形态的影响  86-87
      3.1.1 单增李斯特菌菌体细胞的制备  86
      3.1.2 IgY对单增李斯特菌体细胞作用的透射电镜制片  86
      3.1.3 IgY对单增李斯特菌体细胞作用的超薄切片的制片  86-87
    3.2 IgY与细胞壁组成单体的结合和反应  87
    3.3 IgY与单增李斯特菌的相互作用  87-88
      3.3.1 IgY与单增李斯特菌相互作用后反应液的收集  87
      3.3.2 反应液组分的分析  87
      3.3.3 反应液组分的液相分析  87-88
      3.3.4 反应液组分的核磁质谱分析  88
      3.3.5 反应液组分的气相质谱分析  88
    3.4 数据分析  88-89
  4 结果与讨论  89-104
    4.1 IgY对单增李斯特菌细胞形态的影响  89-90
    4.2 IgY与细胞壁组成单体的结合反应  90-91
    4.3 IgY与单增李斯特菌的相互作用  91-104
      4.3.1 反应液组分的定性分析  91-93
      4.3.2 反应液组分的液相分析  93-96
      4.3.3 反应液组分的核磁质谱分析  96-99
      4.3.4 反应液组分的气相质谱分析  99-104
  5 本章小结  104
  参考文献  104-106
结论与展望  106-109
个人简历  109-110
在学期间发表的学术论文  110-111
致谢  111

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品化学
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