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抗虫基因Cry1Ab转化海棠花的研究
作 者: 谭黎霞
导 师: 王敦
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: Cry1Ab 组织培养 海棠花 叶片 不定芽再生 农杆菌
分类号: S682.19
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 23次
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内容摘要
本试验以海棠花组培苗为材料,对不同浓度激素配比对海棠花增殖生长和叶盘不定芽再生的影响进行了研究,同时,构建了重组植物表达载体pBI121-cry1Ab,并对根癌农杆菌介导Cry1Ab基因转化海棠花进行了研究,旨在建立海棠花离体高效再生体系及转基因体系,为后续深入进行海棠花的转基因研究奠定基础。以下为取得的主要研究结果:(1)以海棠花组培苗和叶片为材料,应用正交试验法,以MS培养基为基础,分别加入不同浓度配比的6-BA/IBA组合和TDZ/IBA组合作为增殖培养基和叶盘不定芽再生培养基,研究了不同植物激素及其配比对组培苗增值、叶片不定芽再生及植株生根的影响,并探讨了不同的叶盘放置方式对其再生的影响。结果表明:添加6-BA 1.0 mg﹒L-1 + IBA 0.1 mg﹒L-1的MS培养基最适宜海棠花组培苗的增殖及生长,增殖倍数高达8.11,海棠花组培苗平均高度达2.14 cm;在添加TDZ 1.0 mg﹒L-1 + IBA 0.5 mg﹒L-1的MS培养基上叶再生效率最高,再生效率为100%,每叶平均再生芽数为6.73;在添加0.3 mg﹒L-1 IBA的1/2 MS培养基上生根效率达65%以上;极性试验结果表明,海棠花以叶盘远轴端接触培养基再生效果较好。(2)通过PCR克隆从Bt C3菌株中得到了Cry1Ab基因编码序列,生测Cry1Ab原核表达产物确定其杀虫活性后,构建了植物重组表达载体pBI121-cry1Ab,用于转基因研究。(3)通过卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性测试和头孢霉素(Cefotaxime Na, Cef)抗性测试研究,确定了最佳的海棠花叶盘不定芽诱导的Kan和Cef临界筛选浓度,分别为25 mg﹒L-1和200 mg﹒L-1。(4)在建立海棠花叶再生体系和构建表达载体的基础上,利用农杆菌介导法对海棠花进行了遗传转化。用含GUS基因的空载体侵染海棠花后,对诱导出来的愈伤组织进行GUS组织化学染色,试验结果显示:GUS阳性率为17.58%;将Cry1Ab基因转化海棠花,经过PCR检测后初步确定2株抗性植株为阳性转化植株。
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全文目录
摘要 5-6 ABSTRACT 6-10 引言 10-11 第一章 文献综述 11-17 1.1 Bt 毒蛋白抗虫植物基因工程研究 11-13 1.1.1 Bt 来源及分类 11 1.1.2 Bt 杀虫晶体蛋白的分子结构与功能 11-12 1.1.3 苏云金芽孢杆菌ICP 的杀虫机理 12 1.1.4 Bt 抗虫基因工程研究进展 12-13 1.1.5 存在问题 13 1.2 苹果属植物叶片再生不定芽技术研究 13-14 1.3 苹果属植物遗传转化研究进展 14-17 1.3.1 遗传转化的基本方法 14-15 1.3.2 苹果属植物转基因研究进展 15 1.3.3 苹果属植物遗传转化存在问题 15-17 第二章 材料和方法 17-29 2.1 材料 17-21 2.1.1 仪器 17 2.1.2 化学试剂 17-18 2.1.3 工具酶和试剂盒 18 2.1.4 植物材料 18 2.1.5 菌株和质粒 18-19 2.1.6 载体 19-20 2.1.7 培养基 20-21 2.2 方法 21-29 2.2.1 PCR 引物的设计及合成 21 2.2.2 PCR 反应 21-22 2.2.3 目的片段分离回收 22 2.2.4 双酶切反应 22-23 2.2.5 连接反应 23 2.2.6 CaCl_2 法制备感受态细胞和连接产物转化 23 2.2.7 碱法小量提取质粒DNA 23-24 2.2.8. 琼脂糖凝胶电泳 24 2.2.9 表达载体的构建和鉴定 24-25 2.2.10. 外源基因在 E.coli 中的表达和检测分析 25 2.2.11 生物活性测定 25-26 2.2.12 海棠花高效再生体系的建立与优化 26-27 2.2.13 根癌农杆菌介导的遗传转化 27-28 2.2.14 转基因植株检测 28-29 第三章 结果与分析 29-39 3.1 Cry1Ab 基因的克隆与测序 29 3.2 重组表达载体的构建 29-31 3.2.1 pET-28a-cry1Ab 重组原核表达载体的构建 29-30 3.2.2 pBI121-egt-F 重组中间载体的构建 30 3.2.3 pBI121-cry1Ab重组植物表达载体的构建 30-31 3.3 融合蛋白在BL21(DE3) 中的表达 31-32 3.4 表达蛋白的杀虫活性测定 32 3.5 植物组织培养 32-37 3.5.1 IBA 与6-BA 不同浓度配比对芽增值及生长的影响 32-33 3.5.2 IBA 与TDZ 不同浓度配比对叶盘芽分化的的影响 33-35 3.5.3 叶片愈伤组织的形成及不定芽的分化 35 3.5.4 海棠花的生根诱导 35-36 3.5.5 叶片极性对海棠花叶再生的影响 36-37 3.6 抗生素浓度对海棠花叶盘再生不定芽的影响 37 3.7 转基因植株鉴定 37-39 3.7.1 GUS 检测 37-38 3.7.2 PCR 检测 38-39 第四章 结论 39-40 4.1 海棠花离体再生体系的建立与优化 39 4.2 苏云金芽孢杆菌Cry1Ab 基因的克隆和原核表达 39 4.4 根癌农杆菌介导的遗传转化 39-40 第五章 讨论 40-42 5.1 海棠花叶片高效再生体系的优化 40-41 5.2 海棠花遗传转化体系的建立 41-42 参考文献 42-46 中英文缩略词对照表 46-47 致谢 47-48 作者简介 48
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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺(花卉和观赏树木) > 多年生花卉类 > 宿根花卉类 > 其他
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