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单一田块核盘菌多样性分析及携带真菌病毒的菌株的遗传特性研究

作　者: 张丽艳
导　师: 姜道宏
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 核盘菌孝感真菌病毒弱毒性菌丝融合群
分类号: S432.44
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)是一种世界性分布的重要病原菌,能够侵染75科450多种植物,常见的重要寄主包括油菜、大豆、向日葵等油料作物和多种蔬菜作物。以油菜为例,由核盘菌引起的菌核病是油菜上的首要病害,一般发病率为10-30%,严重达80%以上,严重影响油菜的产量以及品质。高效、安全的防控措施研究一直是菌核病研究重点。利用致病力衰退相关病毒控制真菌病害是一种重要的生物防治途径。包括核盘菌在内,目前已在很多真菌中发现有致病力衰退相关的真菌病毒,但是所发现的种类极其有限。本论文研究旨在从核盘菌中寻找和鉴定更多的真菌病毒,并研究这些病毒对寄主的影响。从湖北省孝感市郊区同一油菜田(面积约666 m2)的不同发病植株的茎秆病斑上成功分离获得了83株核盘菌菌株,通过对菌丝生长速度、菌丝干重、菌核大小及数量、菌落形态、和致病力等生物学特性进行研究,发现它们在菌落形态、生长速率和致病力等方面存在显著的多样性。经过对其中的30个菌株进行群体菌丝融合群(MCG)的鉴定分析,发现这30个菌株可划分为17个菌丝融合群。其中9个菌丝融合群只包含一个菌株,它们只与自身可进行营养亲和,其余的MCGs包含2至5个菌株。研究还发现,有些菌株尽管来自同一茎秆,它们也会出现菌丝体不融合现象,造成对同一茎秆的复合侵染。这些结果表明即使在很小的范围内,核盘菌也存在复杂的多样性。在这83株菌株中,发现XG36-1菌株与其它菌株在表型上存在显著的差异。这些差异包括XG36-1菌株生长缓慢、菌落呈扇型扩展、气生菌丝发达、产生菌核数量较少且不规则排列于菌落中；在致病力方面,XG36-1菌株几乎不能在离体油菜叶片上形成病斑,致病力极其微弱。XG36-1菌株的表型与实验室早期报道的病毒性弱毒菌株Ep-1pN的类似,是一株弱毒的衰退菌株。为了明确XG36-1菌株的衰退机理,对该菌株进行了以下的研究：(1)XG36-1菌株的原生质体再生子代生物学特性分析；(2)XG36-1菌株子囊孢子后代的生物学特性分析；(3)XG36-1菌株衰退特性的传染性试验；(4)对XG36-1菌株的细胞进行电子显微观测及病毒粒体的分离；(5)病毒性核酸分离和鉴定分析。发现XG36-1菌株的原生质体再生后代按表型可以分为三种类型,即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等,其中约有25.5%的再生植株属于Ⅰ型,约23.8%的再生植株属于Ⅱ型,Ⅲ型再生植株与弱毒菌株XG36-1并没有显着差异,分离频率为51.7%。共获得了104个子囊孢子单孢分离物,它们均具有正常菌株的表型,而与XG36-1菌株有显著的差异。表明XG36-1菌株具有正常菌株的细胞核遗传物质,其衰退系由非染色体遗传物质所致,而且在细胞中分布不均匀。利用农杆菌介导技术转化了核盘菌正常菌株XG36-1A34,筛选并获得具正常表型且抗潮霉素的转化子XG36-1A34R。将XG36-1菌株与XG36-1A34R进行对峙培养,可以自含有潮霉素的PDA平皿中分离到具有XG36-1菌株表型的分离物,表明XG36-1菌株中与衰退相关的遗传因子是可以移动的,具有传染特性。透射电镜显微观测发现XG36-1菌株中的菌丝细胞中存在直径约为40 nm的类似病毒粒体(VLP), XG36-1菌株的子囊孢子单孢分离物的菌丝细胞中没有发现VLP,一旦与XG36-1菌株接触后,将获得出现类似的VLP。采用蔗糖梯度离心的方法可以自XG36-1菌株的菌丝体中分离到少量的VLP。采用纤维素CF-11吸附法自菌丝体中和自纯化的病毒粒体中都没有成功地分离到病毒的核酸。而在这83株菌株中也发现一株XG19-2菌株,它在生长、菌落形态、菌核形成和致病等方面与核盘菌正常菌株没有显著差异。但是,采用CF-11吸附法自其菌丝中提取和分离到大小约为4kb左右的dsRNA片段。利用随机引物对该dsRNA片段进行了cDNA克隆。获得了2个阳性克隆,将近700多bp,通过测序和序列分析,发现这两个阳性克隆均含有一个不完整的阅读框。将其推定的编码的肽链进行Blastp分析,发现这两个肽链均与真菌病毒Diaporthe ambigua RNA virus 1 (DaRVl)的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)具有较高的同源性。表明XG19-2菌株中的dsRNA实质上是一种未知真菌病毒的基因组,命名这种病毒为核盘菌XG19-2 RNA病毒(Sclerotinia sclerotiorum XG19-2 RNA virus, SsXG19-2RV)。本研究证实即使在面积相对较小的油菜田间核盘菌也具有丰富的多样性；分离获得了弱毒菌株XG36-1,并证实其衰退与感染未知的真菌病毒紧密相关,而且存在于菌株XG36-1病毒粒体较少,但是可以使其致病力严重衰退,所以在评估其作为生防因子的价值中有着非常重要的意义。在正常表型的菌株XG19-2中分离和鉴定出一种与DARV1具有显著亲缘关系的新病毒。而Diaporthe ambigua RNA virus 1是可以使洋梨干枯病病原菌毒力衰退,但是XG19-2中SsXG19-2RV病毒并没有对寄主产生影响,这不仅表明虽然同种真菌病毒可以在多种寄主中存在,而且在和不同的寄主互作方式也不同,所以研究SsXG19-2RV可以更进一步了解病毒与寄主之间的关系,而且对深入认识核盘菌及其菌核病的安全控制具有较重要的理论意义和实践价值,同时也丰富了真菌病毒理论体系。

全文目录

摘要  7-10
ABSTRACT  10-15
第一章文献综述  15-36
  1 核盘菌研究进展  15-21
    1.1 核盘菌的生物学特性  15
    1.2 核盘菌的寄主范围  15-16
    1.3 核盘菌的侵染循环  16-17
    1.4 核盘菌致病机理  17-19
    1.5 核盘菌的多样性  19-20
    1.6 作物菌核病的防治  20-21
  2 真菌病毒研究进展  21-35
    2.1 植物病原真菌的弱毒现象  21-22
      2.1.1 弱毒现象的定义  21-22
      2.1.2 植物病原真菌出现弱毒现象的原因  22
    2.2 真菌病毒  22-35
      2.2.1 真菌病毒的分类  22-23
      2.2.2 真菌病毒的的传播  23-29
      2.2.3 真菌病毒与寄主的关系  29-32
        2.2.3.1 真菌病毒的多样性  29-30
        2.2.3.2 真菌病毒对寄主的影响  30-31
        2.2.3.3 真菌病毒与寄主间分子水平的互作机制  31-32
      2.2.4 真菌病毒在生物防治应用上的相关研究  32-33
      2.2.5 真菌病毒的起源  33-34
      2.2.6 在核盘菌中已报道的真菌病毒  34-35
        2.2.6.1 真菌病毒在核盘菌中的最早发现  34
        2.2.6.2 核盘菌Ep-1PN菌株中的SsDRV  34
        2.2.6.3 核盘菌DT-8菌株的DNA真菌病毒  34-35
  3 本研究的目的意义  35-36
第二章来自一小田块的油菜菌核病菌的多样性分析  36-52
  1 材料和方法  36-39
    1.1 培养基及试剂  36
    1.2 样品的采集  36-37
    1.3 核盘菌菌株的纯化和保存  37
    1.4 菌株间生物学特性的比较  37-38
      1.4.1 菌落形态观察  37
      1.4.2 菌株生长速度的测定  37
      1.4.3 菌核形成及分布测定  37
      1.4.4 菌株生物产量测定  37-38
      1.4.5 致病力测定  38
    1.5 菌丝融合群(MCG)的鉴定  38-39
    1.6 数据处理  39
  2 结果与分析  39-50
    2.1 核盘菌菌株分离、纯化  39-41
    2.2 菌株的菌落形态多样性  41-42
    2.3 菌株间菌落生长速度的差异  42-43
    2.4 菌株间菌丝体生物产量的差异  43
    2.5 菌株间菌核的差异  43
    2.6 菌株间致病力的分化  43-45
    2.7 对同一田块菌株的菌丝体融合群鉴定分析  45-50
      2.7.1 同一茎杆内不同菌株之间菌丝融合情况  45-47
      2.7.2 分离自不同油菜茎杆的菌丝融合的鉴定  47
      2.7.3 菌丝体融合群菌株的分析  47-50
  3 结论与讨论  50-52
第三章弱毒菌株XG36-1生物学特性分析及其衰退机理的研究  52-74
  1 菌株XG36-1的培养性状  52-55
    1.1 材料和方法  52-53
      1.1.1 XG36-1菌株的生物学特性研究  52
      1.1.2 核盘菌XG 36-1菌株草酸产量测定  52
      1.1.3 温度对核盘菌XG36-1生长的影响  52-53
      1.1.4 不同pH值对核盘菌XG36-1生长的影响  53
      1.1.5 数据处理  53
    1.2 结果与分析  53-55
      1.2.1 XG36-1菌株的生物学特性  53
      1.2.3 核盘菌XG36-1弱毒菌株的草酸含量  53-54
      1.2.4 温度对核盘菌XG36-1生长的影响  54-55
      1.2.5 不同pH值对核盘菌XG36-1生长的影响  55
  2 原生质体的制备及再生  55-57
    2.1 材料和方法  55-56
      2.1.1 培养基,试剂及酶  56
      2.1.2 原生质体的制备与再生  56
      2.1.3 原生质体再生菌株培养特性及致病力的观察和测定  56
    2.2 结果与分析  56-57
      2.2.1 原生质体再生菌株的菌落形态  56-57
      2.2.2 原生质体再生菌株的生长速度测定  57
      2.2.3 原生质体再生菌株的致病力的测定  57
  3 弱毒株XG36-1的有性遗传  57-59
    3.1 材料和方法  57-59
      3.1.1 弱毒株XG36-1菌核的培养及其萌发的诱导  57-58
      3.1.2 弱毒株XG36-1有性子代的分离  58-59
      3.1.3 弱毒株XG36-1有性子代的培养性状致病力测定  59
    3.2 结果与分析  59
      3.2.1 弱毒株XG36-1有性子代的培养性状  59
  4 弱毒株XG36-1弱毒特性的传染  59-64
    4.1 材料和方法  59-61
      4.1.1 菌株、培养基、抗生素及试剂  59-60
      4.1.2 弱毒株XG36-1有性子代XG36-1A34的抗性标记  60-61
      4.1.3 菌株XG36-1的弱毒因子传递  61
      4.1.4 XG36-1A34R被传染后的表型和致病力的变化  61
    4.2 结果与分析  61-64
      4.2.1 与XG36-1接触后XG36-1A34R菌落特性的变化  61-62
      4.2.2 XG36-1A34RT的特性分析  62-63
      4.2.3 显微镜下观察XG36-1A34RT菌落边缘菌丝顶端形态  63-64
  5 菌丝超微结构的电镜观察  64-68
    5.1 材料和方法  64-65
      5.1.1 缓冲液和试剂  64
      5.1.2 菌丝超微结构的电镜观察  64
      5.1.3 真菌病毒粒子提纯  64
      5.1.4 病毒粒子的电镜观察  64-65
      5.1.5 病毒提纯液的浓度测定  65
    5.2 结果与分析  65-68
      5.2.1 菌丝超微结构的电镜观察  65
      5.2.2 真菌病毒粒子纯化  65-68
  6 弱毒株XG36-1中dsRNA的提取  68-70
    6.1 材料和方法  68-69
      6.1.1 试剂  68-69
      6.1.2 供试菌株  69
      6.1.3 菌丝培养和收集  69
      6.1.4 dsRNA的提取  69
    6.2 结果与分析  69-70
  7 弱毒株XG36-1基因组DNA提取  70
    7.1 材料和方法  70
      7.1.1 溶液及试剂  70
      7.1.2 提取基因组DNA  70
    7.2 结果与分析  70
  8 结论与讨论  70-74
第四章核盘菌菌株XG19-2生物学特性及其真菌病毒研究  74-89
  1 XG19-2生物学特性分析和dsRNA的分离  74-76
    1.1 材料和方法  74-75
      1.1.1 供试菌株  74
      1.1.2 XG19-2菌株生物特性的测定  74
      1.1.3 核盘菌XG19-2中的dsRNA分离  74
      1.1.4 dsRNA的属性检测  74-75
    1.2 结果与分析  75-76
      1.2.1 XG19-2菌株生物特性测定和毒力比较  75
      1.2.2 病毒dsRNA的分离和属性鉴定  75-76
  2 SsXG19-2 RV基因组cDNA克隆及序列分析  76-84
    2.1 材料及方法  76-80
      2.1.1 培养基  76
      2.1.2 载体、引物和电泳的分子量标记  76-77
      2.1.3 试剂、酶及其它药品  77
      2.1.4 菌株的培养及dsRNA提取  77
      2.1.5 dsRNA样品去DNA处理及回收纯化  77-78
      2.1.6 SsXG19-2 RV的cDNA序列的克隆策略  78-79
      2.1.7 回收纯化和载体连接  79
      2.1.8 热激大肠杆菌感受态的制备  79
      2.1.9 热击转化和阳性克隆的筛选  79-80
      2.1.10 SsXG19-2 RV基因组序列的拼接和分析  80
    2.2 结果与分析  80-84
      2.2.1 部分SsXG19-2 RV cDNA序列的克隆  80
      2.2.2 SsXG19-2 RV编码RdRp同源性比较  80-84
  3 原生质体的再生及原生质体再生菌株特性分析  84-87
    3.1 材料和方法  84-85
      3.1.1 材料、试剂与酶  84
      3.1.2 原生质体的制备及再生  84-85
      3.1.3 原生质体再生菌株特性分析及其毒力测定  85
      3.1.4 原生质体再生菌株中dsRNA的提取  85
    3.2 结果与分析  85-87
      3.2.1 原生质体再生菌株菌落形态  85
      3.2.2 原生质体再生菌株特性分析  85
      3.2.3 原生质体再生菌株中dsRNA的提取  85-87
  4 结论与讨论  87-89
结论与展望  89-91
参考文献  91-104
致谢  104

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